PI3KCA基因对乳腺癌细胞放射敏感性的影响.doc

PI3KCA基因对乳腺癌细胞放射敏感性的影响 宋晓宇1，于海洋1，韩凤云2 （1 吉林大学白求恩医学部 130000） （2 胶州市人民医院 266300） 【摘要】目的：构建MCF-7 PI3KNC/MCF-7 PI3KCARi细胞模型，即MCF-7细胞的PI3K-NC基因稳定转染组（对照组）/MCF-7细胞的PI3K-CA沉默组（沉默组），探讨PI3KCA基因对乳腺癌细胞MCF-7放射敏感性的影响。 方法：通过脂质体转染方法，沉默乳腺癌细胞株的PI3KCA基因，构建MCF-7 PI3K-NC/MCF-7 PI3K-CARi细胞模型；通过实时定量PCR检测基因沉默的有效性；CCK-8方法检测细胞模型在0、2、4、6、8Gy射线照射下的细胞存活率，确定PI3K-CA基因沉默细胞的放射敏感性。 结果：实时定量PCR结果证明细胞模型构建成功；在0、2、4、6、8Gy剂量下，对照组的细胞存活率分别为1.000±0.067、0.982±0.028、0.863±0.071、0.727±0.020、0.627±0.034。沉默组的细胞存活率分别为1.000±0.044、0.910±0.076、0.786±0.050、0.705±0.029、0.643±0.024； 结论：已成功构建MCF-7 PI3KNC/MCF-7 PI3KCARi细胞模型，沉默组细胞的放射敏感性高于对照组。说明沉默PI3K-CA基因能够提高乳腺癌细胞MCF-7的放射敏感性。 【关键词】乳腺癌；PI3KCA；放射敏感性。 乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率是女性肿瘤疾病首位。尤其在北美、西欧等发达国家，其发病率位居妇女恶性肿瘤之榜首, 大约每年出现1100000例乳腺癌新诊断病例。相比欧美国家来说，中国虽然是乳腺癌的低发国家, 但在过去的20 多年中，乳腺癌的发病率不断增加，目前临床上，对于乳腺癌的治疗方法主要有手术、放疗、化疗和内分泌治疗等。其中放疗是一种重要的治疗手段，特别是在保乳术的治疗方案中尤其如此。因此,研究乳腺癌细胞对放射治疗的敏感性对临床工作的诊治具有重要的意义。磷脂酞肌醇-3-激酶(phosphoinositide?3-kinase,PI3K)在细胞调节中有主要作用价值,现已发现PI3K和肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、浸润及转移等密切相关。P13K与ATM、ATR、DNA一PK等，均属于PIKs家族成员,它们在调节细胞放射敏感性中起着重要作用,现已证明PI3K和细胞放射阻抗性相关。相关文献显示，超过30%的乳腺癌患者存在PI3KCA的基因突变。Woenckhaus 等的研究也提示，阻断 PI3K 活性及其下游靶点 Akt 在恶性肿瘤中起重要作用，收获或扩增编码催化亚基 p110α 的 PI3KCA 基因，其表达增加与卵巢癌细胞系PI3K活性增加有关 ，且PI3KCA 扩增和 Ki-67 指数是早期肿瘤相关死亡的强力预测因子。 因此,笔者探索PI3K传导路径与乳腺癌细胞的放射敏感性的相关性。 材料与方法 1、主要试剂与仪器 PCR所需引物及RNAiso plus、SYBR Premix Ex Taq试剂盒(荧光为SYBR Green I)试剂盒等均购自大连宝生物公司；慢病毒汤PI3KNC/PI3KCA购于上海吉玛制药技术有限公司； CCK-8试剂(日本同仁化学)。 2、方法 2.1 细胞培养 人乳腺癌细胞系MCF-7DMEM培养液（含10%FBS及青霉素与链霉素各100U/mL），37℃，5%CO2培养箱中培养，用0.25%胰酶(含0.2%EDTA)消化并传代，取对数生长期细胞进行实验。采用静止贴壁培养法，将筛选后的细胞进行扩增。细胞系生长在含15%小牛血清的培养基中，于37℃、5%CO2条件下置于培养箱中培养。每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况，及时进行细胞分瓶：在无菌超净工作台上操作，用吸管小心吸出旧培养液，加入适量消化液（胰蛋白酶液），最佳消化温度是37℃。2~3分钟后，置于倒置显微镜下观察消化细胞，当大部分细胞出现胞质回缩，细胞之间不再连接成片时，弃去胰蛋白酶液，加入培养液终止消化。用滴管将已经消化的细胞吹打成细胞悬液，将细胞悬液吸入10ml离心管中，平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心5分钟后，小心弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。将培养的MCF-7细胞分为PI3K-NC稳定转染组（简称对照组）和PI3K-CA沉默组（简称沉默组）。 2.2 慢病毒转染 用药物空筛，以确定MCF-7细胞对嘌呤霉素(puromycinPM )的最小致死剂量。 转染试验前一天分别接种（