RNA的提取.doc

总RNA提取 [实验目的] 掌握组织或细胞中RNA的提取方法及RT-PCR实验方法 [实验原理] Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。 无论是人、动物、植物还是细菌组织，各种样品最大使用量（1ml Trizol），动物组织( 50mg)，植物组织(100 mg)，丝状真菌( 100mg)，动物细胞(5×106～1×107)，酵母(1×107) 。 TRIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8 。 [实验用品] 【实验耗材】 1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl。酒精擦拭，头部重点，紫外线照射。 2、吸头：1ml、200μl、20μl 3、匀浆管：5ml 4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个 5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl 6、试剂瓶：2个60ml的棕色广口试剂瓶。青霉素小瓶（分装无水乙醇，高压的DEPC水，－20°C保存）。 7、量筒：50ml、250ml、500ml 8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml 9、试管架：5ml、1.5ml、20μl 10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水 11、铝制饭盒：4个 12、塑料小饭盒：1个 13、大瓷缸：2个 14、锡泊纸：一卷 15、卷纸：2卷 16、三角烧瓶：带盖，稍大（融琼脂糖） 【实验仪器】 天平、振荡器、高速离心机、0.5～10ul、20～200ul、100～1000ul加样器。 【自备试剂】 DEPC(焦碳酸二乙酯ml＋1000ml双蒸水＝1‰ DEPC水，1000ml容量瓶中静置4小时。 2.75%乙醇：无水乙醇+DEPC水，-20℃保存（DEPC水需先高压） 3.氯仿：棕色瓶 4.异丙醇：棕色瓶 【器具处理与准备】 1.塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等） 先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，小枪头需打入DEPC水，室温过夜，高压，烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）。胶塞同样处理。塑料器皿也可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。 2.玻璃制品： 泡酸过夜，冲洗干净，1 ‰DEPC过夜，蒙锡纸，150°C烘烤4h，180°C，2h。或泡酸过夜，冲洗干净后高温烘烤，1 ‰DEPC过夜，高压。盛装乙醇，DEPC水用。 3.匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC） [实验内容和方法] 一、抽提 （一）组织抽提 1.组织取材后用灭菌的锡箔纸包好保存于液氮。实验时，在液氮中将组织研磨成粉末，趁液氮未挥发将粉末转移到EP管，室温5000rpm离心去上清。每50-100mg组织，加入1ml Trizol。 2.若是新鲜标本经匀浆后转移离心管，加入1ml Trizol。 3.若组织量(1～10 mg)或细胞数很少(102～104)，在样品中加入800 ul Trizol反复抽吸均匀，再加入糖原(终250ug/ml),剧烈振荡或用匀浆器匀浆。 4.在匀化后和加入氯仿之前，样品可以在–60～70°C保存至少一个月。 （二）细胞抽提 1.倒掉培养基，PBS洗，直接将1ml Trizol 注入培养瓶（5×106），反复抽吸均匀。 2.或收集细胞后加入Trizol 反复抽吸均匀。 二、分相 3.在装有裂解物的离心管中加入0.2ml的氯仿(为Trizol总体积的1/5),振荡混均30秒，室温下静置5分钟. 4. 12000 rpm 15分钟4(C,分相为三层。上层：RNA(约为Trizol的60%)；中间：DNA；下层:蛋白质(酚-氯仿)。 5.小心吸取上清液，转移到另一EP管中。1ml裂解物产生的上清液体积约为0.4～0.6 ml。有机相和中间层含有DNA和蛋白质,避免触及。 三、RNA沉淀 6.上清液加