第21章基因诊断与基因治疗.ppt

第 二 十 一 章 基因诊断与基因治疗 Genetic Diagnosis and Gene Therapy 基因(gene) 基因是为生物活性产物编码的DNA功能片断，这些产物主要是蛋白质或各种RNA。 第 一 节 基因诊断 Gene Diagnosis （三）、特点 针对性强 特异性高 灵敏度高 适用性强，诊断范围广 二、 基因诊断常用技术方法 （一）、核酸分子杂交(molecular hybridization)技术 核酸分子杂交可用以检测样本中是否存在与探针序列互补的同源核酸序列。 核酸探针 是一类具有放射性标记或化学标记的并与目的目的DNA或RNA分子序列互补的寡核苷酸片段。 探针是能够同某种待研究的核酸序列或蛋白多肽链特异结合的任何分子，经标记之后可用来检测目的DNA/RNA 或蛋白质分子。 实验流程：提取DNA→(限制酶切)→凝胶电泳→膜转移→杂交→放射自显影→分析 建立在核酸杂交技术基础上的常用基因诊断方法 1、限制性内切酶(restriction endonuclease)酶谱分析法 2、DNA限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析法 3、等位基因特异寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO)探针杂交法 1、限制性内切酶酶谱分析法 是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异的一种方法。 2、DNA-RFLP分析法 中性突变是指在人基因组中，平均每200对碱基可发生一对变异的现象。 DNA多态性是指中性突变导致个体间核苷酸序列的差异。 限制性片段长度多态性是指DNA多态性若发生在限制性内切酶识别位点上，酶切水解该DNA片段就会产生长度不同的片段。 3、ASO杂交法 根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成相应于正常和突变基因碱基序列的两种寡核苷酸探针，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交来检测是否存在等位基因突变。 ASO杂交法 探针：M N M N M N M N 正常基因 纯合突变 杂合突变 基因缺陷 （新的突变类型？） （二）、聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) 是利用特异的引物，特异地扩增目的DNA的方法。 实验流程：提取DNA→PCR→凝胶电泳→显色→分析 2、常用的PCR方法： 常规PCR、巢式PCR、多重PCR、多种PCR、不对称PCR、反转录PCR、定量反转录PCR、mRNA差异显示PCR、原位PCR、实时PCR等等。 3、在PCR技术基础上的常用基因诊断方法 PCR-SSCP法* PCR-ASO法 PCR-RFLP法 PCR-限制酶谱法 PCR-STR（短串联重复序列，short tandem repeat） PCR-SSCP分析 是指PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。 （三）、基因测序(gene sequencing) 即测定某一基因的碱基序列。 实验流程：提取DNA→分离出有关基因→测序→分析诊断 基因测序的方法： 化学裂解法 DNA链末端合成终止法 DNA自动测序 （四）、基因芯片（gene chip) 基因芯片，又称DNA芯片、DNA阵列、寡核苷酸微芯片（DNA chip、DNA arrays、oligonucleotide micro-chip）—是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出定性和定量的结果。 基因芯片的应用 1、在诊断中的应用 核酸序列分析、基因表达分析、寻找新基因、突变基因和基因多态性检测等 2、在药学研究中的应用 药物筛