高效液相色谱法原理与应用-.ppt

* 评价色谱柱好坏的标准 1）理论塔板数N 2）拖尾因子Tf 3）色谱柱背压 4) 色谱柱批与批之间的重现性 5）pH值的适用范围 6）使用寿命 * 拖尾因子Tf As = 1.0-1.05 很 好 As = 1.2 一 般 As = 2 差 As = 4 很差 不对称因子 和拖尾因子的关系 As (at 10%) Tf (at 5%) 1.0 1.0 1.3 1.2 1.6 1.4 1.9 1.6 2.2 1.8 2.5 2.0 不对称因子 (As) = B A A 拖尾因子 (Tf) = A + B 2A 10% 峰高 5% 峰高 * 色 谱 柱 背 压 粒径均一会使色谱柱的背压相对较低。 色谱柱两端的压力降不应超过公式计算所得的30％。 硅胶粒径对色谱柱的压力具有很大的影响；硅胶粒子越小，色谱柱的背压越大。 色谱柱的背压还与流动相的粘度有关。 P = 3000Lη t0dp2 P 是色谱柱背压 (psi)，L 是色谱柱的长度 (cm), η 流动相的粘度 (cP)， t0 是色谱柱死时间, dp 是粒子的直径 (μm) * 为什么色谱柱会失去作用? 部分原因是色谱柱塞板或柱床被堵塞 —— 导致色谱柱背压上升、峰形拖尾和柱效下降。 吸附了样品杂质 —— 导致柱效下降、选择性和保留时间改变。 色谱柱没装填好 —— 导致柱效下降和峰形拖尾。 物理损伤或受热引起的缺口 —— 导致柱效下降和峰形拖尾。 对硅胶基质或键合相的化学腐蚀 —— 导致选择性变弱、峰形拖尾、保留能力下降（或对碱性化合物的保留能力增强）。 * 现代高效液相色谱柱的要求 超纯 B 型球形硅胶 —— 峰形好、柱效高。 不能有使色谱性能降低的直径小于50 ?的微孔。 粒径尺寸从 3 μm 到 10 μm ——能满足从分析到制备色谱规模的需求。 色谱柱柱床装填好 —— 使用寿命长、柱效高。 封尾彻底 —— 峰形好、使用寿命长。 批与批之间得重现性好。 不同的相具有不同的选择性 —— 能更好的实现分离。 键合相化学稳定好 —— 适用的 pH 范围广, 使用寿命长。 * 为什么反相色谱应用如此广泛? 它能使中性化合物和极性化合物在一根色谱柱中得到分离。 适用于多种基体中的多类不同性质化合物的测定和分离。 保留时间可以用分子的疏水性进行描述和解释。 所用高纯度的水、甲醇和乙腈等溶剂价格便宜、实用。 选择性可通过用缓冲溶液进行调节（通过调节pH值来调节离子强度和胶团粒子大小等等），以实现最佳分离。 * 7. 检测器的保养 在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；紫外检测器的平衡时间大约需要20分钟，示差折光检测器则更长。在分析完成后，马上关闭检测器。 检测池污染时，将柱拆下，用合适的溶剂冲洗污染物。 * * * * 2.环境分析 * * 3.药物分析 * * 人参皂苷的分析 * 5. 农药分析 * 第4章 仪器使用细节 * 1.HPLC用水 专门的纯水机或超纯水机； 去离子水重蒸； 二次或三次重蒸水； 采用类似家用的纯水机； 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水； 其它途径； * 2. 样品 溶解样品用溶剂最好是流动性，或者用溶剂强度与流动相相近的溶剂。 进样样品要求无微粒，样品溶液均要用0.45μm的滤膜过滤。 * 3.流动相的配制 流动相通常按体积比配制。 流动相在使用前一般都需要过滤，尤其使用了加缓冲盐的流动相时。 如果没有自动脱气装置，流动相配好后应该采用合适的方法脱气，如超声波脱气，真空脱气、氦气脱气等。 * 在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。尽快转动阀，不能停留在中途，否则过高的压力在柱头上引起损坏。 六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20μl的定量环最少进样60至100μl的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。 4. 六通阀的使用 * 防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗，。 * 5.泵的保养 使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀；