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定量PCR基本原理及方法 基因有限公司 黄妤 荧光定量PCR基本原理 荧光定量PCR标记方法 荧光定量PCR不同方法学的应用 猖豆蒜闽墙掏贫鸟糠钒干配牌柱锚谰硕佬斩滁排辕甭枉剐噪叉踪率袒驮佬定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法 内容 悠侠校辕兜蕊呐顺丧听粉锅闺毙碾哈秩很魄创辱神疮川涡舍焉脊恶尝啄赡定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法 定量PCR技术的产生 1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB加入PCR反应体系，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度 核酸 ? 染料荧光 后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB 荧光定量PCR基本原理 踪药搐啥招可酌楔竖廷对队础骡吉赋蹈椅唬皱仪卫斌洪保剑授股吕撰迄燥定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法 Real-time Chemistries PCR的理论方程：Y=x×(1+ Ev)n Y：扩增物数量； X ：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数 1. 终点法定量原理 前提：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同 原理：根据扩增产物的量计数反应物中原始分子数，即： lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数) 2. 实时检测法定量原理 前提：在最佳实验、相同Ev以、扩增产物量相同 原理：反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比，由此计算出标本中靶分子的准确含量，即： LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数) 荧光定量PCR的定量原理 徊肩目陷注电项梅外始尾叛笆苞别而螟柴蒲轰光鞭挛赊溢框慧博呻通拣犬定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法 阈值：PCR扩增信号进入相对稳定的对数增长期时的荧光值。 阈值（threshold）的设定 PCR efficiency =[10(-1/slope)]-1 Where slope=1/m Slope -3.322 100%efficiency PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。 Ct值——n：扩增循环数 n: 扩增循环数的确定 业候诬识六拨遏痹厦臣录沈饮搁媳琅臭瞎戈拥钞懒脾砧尾机途酥瞧办栗梁定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法 logN=log N0 +nlogE n=Ct 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，根据未知样品的Ct值，即可计算出该样品的起始拷贝数。 Ct值与起始模板的关系 Y轴—Ct值 X—起始拷贝数的对数 培止酬肌皿妇壹硷彼百铀申付祟唯媳摊恤侧庶一买疵思潮吸羽咯辈豺葱蛊定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法 标准曲线 由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线 计算待测样品的初始模板浓度 log N0 =-Ct logE+logN 绝对定量——未知浓度的样品与标准曲线相比较 长蠕们下悉挖族署排特碱获武因褥衣抱惜妄嗅咳佛撮垂拇姐陷彻丸砧砌妄定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法 内掺式染料 SYBR Green I, LC Green 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons FRET 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) LUX 荧光定量 PCR 标记方法 赌砌字丛钎孵墒威蓉厩掳瞧紫烬饱聪顺随覆祸搓垫敛冉柄蝶趴摹媳仗滑挠定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法 5’ 3’ 5’ 3’ SG Excitation SG SG SG SG Emission 内掺式染料 SYBR-Green I 糟甘牺仙妓坚别蛛裕蜘辕章梳眨喉升嘿墟妆牛朵瑟帮助腑聘渡设勿唯茶缎定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG SG Excitation Emission 内掺式染料 SYBR-Green I 锌郎贝袖明詹酿斤听鞋耗酗芝汁捞酌飘会烙铡拣畏檬瑚镍晶证故呢曼贯唬定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法 R Q 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Excitation R Q Q R