荧光定量PCR.pptVIP

DNA样品的获取和目的片段的PCR扩增 扩增区域 Biotin Primer down Primer up Biotin PCR扩增和目的片段的标记 人乳头瘤病毒分型基因检测芯片 人乳头瘤病毒（Human Papillomaviruses, HPV） 双链DNA无包膜病毒 环状DNA，约8Kb 病毒颗粒直径为50～55nm。 依靠宿主细胞进行复制、转录和翻译。 广泛分布在高等脊椎动物 有很高的种属特异性 定向感染皮肤及粘膜的复层鳞状上皮 型别与分布 已发现100多种不同的亚型，其中超过40种可以感染人类的生殖器官，约30种与肿瘤有关。 依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低可分 1）低危型：宫颈上皮内低度病变，引起外生殖器湿疣等良性性病（HPV 6、11、42等） 2）高危型：宫颈上皮内高度病变，与宫颈癌的发生有关（HPV 16、 18、31、33、35、39?、45、51、52、53、56、58、59、66及 68等） 某些亚型有地理位置的差异 HPV与宫颈癌 宫颈癌的病因学研究进展 ： 早在十九世纪四十年代，一位意大利医生Regoni Stern最早提出结婚与否与宫颈癌的发生可能有关。 1977年Laverty在电镜中观察到宫颈癌活检组织中存在人乳头状瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）颗粒。 至89年左右，约翰.霍普金斯大学教授Keerti Shah证实子宫颈癌与HPV感染有直接关系。 1995年世界卫生组织国际癌症研究所（IARC）专题讨论会认为：HPV感染是宫颈癌发生的主要病因。 HPV与宫颈癌的发生有95%以上的相关性 高危型HPV的持续性感染，是女性宫颈癌发生的主要原因。潜伏期在1.5到5年左右 宫颈病变CIN3组织切片中HPV的检出率为99.7％ 目前已经确定高危型HPV的持续性感染是宫颈癌患病的关键病因 HPV与宫颈癌 标本的采集 标本采集时间对扩增检测结果的影响 标本采集部位的准备 标本采集的类型和采集量 采样质量的评价 采样及运输容器 标本采集中的防污染 标本采集时间对扩增检测结果的影响 在疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果 标本采集部位的准备 标本采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生物或其他杂物，但应适度，过度的清洁消毒有可能会去掉或破坏靶微生物，故标本采集部位的准备应由训练有素的人员进行。 标本采集的类型和采集量 标本的类型和采集量应根据所测病原体而定 TB 痰液 HBV 血清或EDTA抗凝血浆200ul HPV CT 宫颈或尿道分泌物 采样质量的评价 主要观察有无溶血，脂浊，异物等现象 采样及运输容器 标本的采集材料如棉签、注射器应为一次性使用 运输容器亦应为密闭的一次性装置 采集标本所用的防腐剂、抗凝剂及相关材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰 严禁使用肝素抗凝 标本采集中的防污染 标本采集最好用一次性材料，不用处理便可直接使用 采集中要特别注意污染，防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液等 如使用玻璃器皿，必须经250°C干烤4小时或用DEPC水处理，以使可能存在RNAase失活 标本的稳定化处理 用于DNA检测的标本，采集后一般不需要特殊的稳定化处理，但标本应及时送至实验室 用于RNA检测的标本，由于RNA易受RNA酶的降解，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1:4的比例加至含有5mol/L GITC（异硫氰酸胍盐）的试管中，从而使血清(浆)中的RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可运送。 标本的运输 标本采集后必须尽快送至实验室 经过适当稳定化处理的标本可在常温下运送（如 用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于 RNA 扩增检测的经GITC稳定化处理的标本）通 常在运送时应采用不易破碎的容器装载标本 用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，则 必须速冻后，放在干冰中运送 标本的保存 临床体液标本如血清/血浆等可于-70℃下长时间贮存 用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10mmol/L Tris， 1 mmol/L EDTA缓冲液(pH 7.5-8.0)中4℃保存 用于RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80℃ 或液氮中贮存；用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20℃ 即可；用GITC处理的RNA标本在室温可保存7天 实验室分区管理平面图 试剂准备区（Ⅰ 区） 使用所有试剂都已经准备好备用的商品试剂盒 时还需要试剂准