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一、色谱法（气相、液相）简介1、原理不同的物质在由两相—固定相和流动相构成的体系中，具有不同的分配系数。当两相做相对运动时，这些物质也随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配。分配系数上有微小差别的物质在移动速度上产生差别，从而使各组份达到分离。2分类按流动相物态分：气相色谱、液相色谱按系统特征分：柱色谱、薄层色谱、纸色谱按分离原理分：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱3. 气相色谱法的特点优点：1.高效能：可分析沸点十分接近、组分复杂的混合物2.高选择性：能分离性质极为相似的组分，如同位素、异构体；3.高灵敏度：~10-11g物质，可检出ppm~ppb含量的组分；4.快速：几分~几十分钟可完成分析；5.应用范围广：气体、液体、固体；热稳定性良好的物质；6.样品用量小。缺点：1.不能直接定性；不如IR、NMR、MS等技术；2.不适用于分离沸点高、热稳定性差的化合物，应用范围受温度限制；3.定量时需要被测物的标准样品作对照。4.气相色谱分析方法建立步骤样品的来源和预处理方法确定仪器配置确定初始操作条件载气流速曲线上的最低点，塔板高度最小，柱效最高。该点所对应均流速即为最佳载气流速。在实际分析中，为了缩短分析时间，选用的载气流速稍高于最佳流速。进样量最大允许的进样量应该控制在使峰面积或峰高与进样量呈线性关系的范围内。进样口温度检测器温度、燃气和助燃气的比例色谱柱温度分离条件优化含量测定方法内标法外标法归一化法方法验证高效液相色谱1定义：High Performance Liquid Chromatography高效液相色谱法，简称：HPLC是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段：高性能的色谱柱高精度、耐高压的输液泵高灵敏度的检测器……2高效液相色谱法的特点高压：150-350*105 Pa高效：大于30000塔板/米高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）3.HPLC与GC差别1.分析对象的区别GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测占有机物的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测。用途广泛，占有机物的80%2．流动相差别的区别GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。3．操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）反相液相色谱（RPLC)：依据因溶质疏水性的不同而产生的溶质在流动相与固定相之间分配系数的差异而分离。流动相的极性比固定相强。正相色谱：依据溶质极性的不同而产生的在吸附剂上吸附性强弱的差异而分离。流动相的极性比固定相弱。离子交换色谱（IEC）：基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH-固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。HPLC的仪器配置及流程1.高压输液泵2.HPLC进样装置3 高效液相色谱柱4 检测器a. 紫外可见光检测器b. 示差折光检测器C 荧光检测器D 电导检测器反相色谱研究历程HPLC思考题1、流动相使用前为什么要脱气？ (1)、流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。(2)、在反相液相色谱分析中，流动相的PH值一般在2.5－7之间。2、反向色谱中流动相极性增加保留时间变大。样品的保留值也可以通过改变流动相组成或溶剂强度来调整，溶剂强度取决于有机溶剂的性质和其在流动相中的浓度。在反相色谱中，采用高溶剂强度、低极性的流动相时可获得较低保留值。联用思考题见小字红外紫外红外分光光度计区别？？样品要求（1）样品必须预先纯化，以保证有足够的纯度；（2）样品须