第四章基因克隆的酶学基础2014题库.ppt

三、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）???? 主要来源于: 牛小肠碱性磷酸酶（Calf intestinal alkaline phosphatase），简称 CIP 或 CIAP 细菌的碱性磷酸酶（Bacterial alkaline phosphatase, BAP） 作用 催化除去 DNA 或 RNA 5‘ 磷酸的反应 用于防止 DNA 片段自身连接，或标记（5‘ 端）前除 DNA 或 RNA 5 磷酸 第四节? 其它酶 一、依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶 （DNA dependent RNA polymerase）???? SP6 噬菌体 RNA 聚合酶 （来源于感染鼠伤寒沙门氏菌 LT2 菌株） T4 或 T7 噬菌体 RNA 聚合酶 （来源于噬菌体感染的大肠杆菌）。 1．活性 ????这些 RNA 聚合酶实际上为转录中的 RNA 合成酶，识别 DNA 中各自特异的启动子序列，并沿此 dsDNA 模板起始 RNA 的合成。它与 DNA 聚合酶不同，无需引物，但需识别特异性位点。 2．用途????① 体外合成 RNA 分子。 ????② 用于表达外源基因。 二、核酸外切酶 （nuclease）? 单链外切核酸酶 大肠杆菌外切核酸酶I和VII：两头降解，产生2-25bp寡核苷酸片段 双链外切核酸酶 大肠杆菌外切核酸酶III:双链DNA从3‘OH末端开始降解，释放5’单核苷酸 从 dsDNA 3‘-OH 逐一去除单核苷酸的反应，底物为 dsDNA 或线状和带切口或缺口的环状 DNA ，反应结果是在 dsDNA 上产生长长的单链区。 该酶还有对无嘌呤 DNA 特异性内切核酸酶活性、 RNase H 活性和 3‘-磷酸酶活性（去磷酸）。 不降解核酸内的磷酸二酯键，也不降解单链 DNA 及带 3‘ 突出的 dsDNA 。 持续作用能力不强，产物为切割程度不相上下的群体，有利于分离长短不等的 DNA 。 三 单链核酸内切酶 1．BAL31 核酸酶（BAL31 nuclease）来源于交替单胞菌（Alteromonas espejiana）BAL31 主要活性为 单链特异的核酸内切酶活性,从3’羟基末端迅速降解DNA 依赖 Ca++ ,而且 EGTA(乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸） 可抑制其活性。双链的核酸外切酶活性：可从线性 DNA 两条链的 两端迅速去除单核苷酸 用途 从两头缩短 DNA ，用于构建嵌套缺失体 制作 DNA 限制酶切图; 确定 DNA 二级结构 从单链 RNA 上去除核苷酸。 2．Sl 核酸酶（S1 nuclease） 来源于米曲霉（Aspergillus oryzae） 降解单链 DNA 或 RNA ，产生带 5‘ 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链,是一种高度单链特异的核酸内切酶 对 dsDNA、 dsRNA 和 DNA:RNA 杂交体不敏感。 活性需 pH4.0-4.3,Zn2+ 酶浓度大时可完全消化双链，中等浓度可在切口或小缺口处切割双链。 作用：分析 DNA:RNA 杂交体的结构； 去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端； 打开双链 cDNA 合成中产生的发荚环。  3．核糖核酸酶 A （Ribonuclease A 或 RNase A） 来源于牛胰，为内切核酸酶 可特异攻击 RNA 上嘧啶残基的 3‘ 端 可用于 除去 DNA:RNA 中未杂交的 RNA 区， 确定 DNA 或 RNA 中单碱基突变的位置。 广泛用来去除 DNA 样品中的 RNA 。???  4．脱氧核糖核酸酶 Ⅰ （DNase Ⅰ） 来源于牛胰，是内切核酸酶 可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链 DNA 。产物是以5’-磷酸为末端的寡核苷酸。 在 Mg2+ 存在下，独立作用于每条 DNA 链，且切割位点随机。 在 Mn2+ 存在下，在两条链的大致同一位置切割 dsDNA ，产生平端或 1-2 个核苷酸突出的 DNA 片段。 用途 切口平移标记时在 dsDNA 上随机产生切口； 在闭环 DNA 上引入单切口，以将分子截短（在亚硫酸氧盐介导的诱变前）； 建立随机缺失的嵌套缺失体，用于功能分析或 测序； 在 DNA 酶足迹法（DNA footprinting）中分析蛋白:DNA 复合物； 除去 RNA 样品中的 DNA 。 7．核糖核酸酶 H（Ribonuclease H 或 RNase H） 内切核酸酶，特异性水解与 DNA 杂交的 RNA 上的磷酸二酯键，产生带有 3‘-OH 和 5’ 磷酸末端的