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利用ACGM标记发掘杉科功能基因 摘要：利用４对日本柳杉（ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）的扩增共有序列遗传标记（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ，ａｃｇｍ）引物，在杉科７个属的１１份材料中扩增出了２５个ｐｃｒ产物，测序、ｂｌａｓｔ比对和联配结果表明，４对引物的扩增产物分别与拟南芥和日本柳杉的４个基因（ｍｙｂ基因、ｃｃｃｈ－型锌指蛋白基因、查尔酮合成酶基因、抗冻相关基因ｃｏｒ４７）具有较高的相似度性，推测这些ｐｃｒ产物为这４个基因在杉科物种中的同源基因片段。研究结果表明ａｃｇｍ标记可被用于发掘其他物种的功能基因片段。 关键词：ａｃｇｍ；杉科；功能基因；同源基因 ｕｓｉｎｇ ａｃｇｍ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ exploring ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔａｘｏｄｉａｃｅａｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｊｉａ ｑｉｎｇ，ｔｏｎｇ ｚａｉ－ｋａｎｇ，ｌｕ ｙｏｎｇ－ｑｕａｎ （ｎｕｒｔｕｒｉｎｇ ｓｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔａｔｅ ｋｅｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ ｓｉｌｖｉｃｕｌｔｕｒｅ， ｚｈｅｊｉａｎｇ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｏｒｅｓｔｒｙ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｌｉｎ＇ａｎ ３１１３００，ｚｈｅｊｉａｎｇ，ｃｈｉｎａ） ａｂｓｔｒａｃｔ： ４ aｍｐｌｉｆｉｅｄ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ （ａｃｇｍ） ｏｆ ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｐｌｏｉｔ ｎｏｖｅｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ． ２５ ｐｃｒ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ １１ ｓｐｅｃｉｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔａｘｏｄｉａｃｅａｅ ｆａｍｉｌｙ． ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， ｂｌａｓｔ ａｎｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｃｒ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｈａｄ ｈｉｇｈ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗｉｔｈ ｍｙｂ ｇｅｎｅ， ｃｃｃｈ－ｔｙｐｅ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ， ｃｈａｌｃｏｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｃｏｌｄ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｏｆ ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ａｎｄ ｃ． ｊａｐｏｎｉｃａ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｔｈｕｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｇｅｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｇｅｎｅ． ｉｔ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ａｃｇｍ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ． ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ａｃｇｍ； ｔａｘｏｄｉａｃｅａｅ； ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ； ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｇｅｎｅ 扩增共有序列遗传标记（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ，ａｃｇｍ）是基于表达序列的保守性开发的分子标记［１］，该标记的引物在表达序列的保守区内，引物本身就是表达序列的一部分，因此ａｃｇｍ引物的ｐｃｒ扩增产物是表达基因序列的片段。利用ａｃｇｍ标记不仅可以探明所研究物种之间的多态性信息，而且可以获得大量目的基因的同源片段。本研究利用日本柳杉（ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）ｍｙｂ（mｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ）基因［２］、 ｃｃｃｈ－型锌指蛋白（ｃｃｃｈ－ｔｙｐｅ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）基因［３］、查尔酮合成酶（ｃｈａｌｃｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）基因［４］和抗冻相关（ｃｏｌｄ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）基因ｃｏｒ４７［５］的ａｃｇｍ引物，在１１份杉科材料中进行ｐｃｒ扩增，对ｐｃｒ产物测序和比对，以探讨利用ａｃｇｍ标记快速获得目的基因片段的可行性。 １ 材料与方法 １．１ 引物序列及推测功能 ４对日本柳杉ａｃｇｍ引物序列及所在基因的功能见表１。 １．２ 植物材料 杉科７个属的１１份植物材料（表２）于２０１０年１０月采自杭州植物园裸子植物园区，用冰盒保存带回实验室，采用ｃｔａｂ法提取植物叶片的ｄｎａ［６］。 １．３ ｐｃｒ扩增 ｐｃｒ反应体系为：ｄｎａ（２５ ｎｇ／μｌ） ２ μｌ，ｔａｑ ｄｎａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ ｕ／μｌ， ｔａkａrａ） ０．２ μｌ，正反向引物（１０ μｍｏｌ／μｌ）各１ μｌ，ｄｎｔｐｓ（１０ ｍｍｏｌ／ｌ， ｔａkａrａ）１．６ μｌ，１０×ｐｃｒ ｂｕｆｆｅｒ ２ μｌ，加ｄｄｈ２ｏ到２０ μｌ。反应条件为：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性３０ ｓ，５５～５８ ℃