利用小随体多重PCR和带型分析鉴别酿酒酵母菌株.docVIP

第一学习小组 段志峰 朱江 邢英超 刁文涛 冯延宾 张熠 唐亦辰 黄云 何骁男 利用微卫星多重PCR和带型分析鉴别酿酒酵母菌株 摘要 我们提出了一种利用多重PCR对微卫星位点多态性分析快速鉴别酿酒酵母菌种的方法。 无需使用苯酚，简单提取DNA，利用多重PCR扩增SC8132X, YOR267C 和SCPTSY7位点，用琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行带型分析，这种方法可使我们区分30种商用葡萄酒酿酒菌种。该方法被成功应用于一项在15和20摄氏度这两个发酵温度下检验两个菌株间的显性关系的生态学研究中。 这种方法在酿酒和酵母生产工业中常规的低成本检测酵母菌株的过程中应该有应用价值。 关键词：微卫星，PCR，酵母菌株，葡萄酒，发酵 1.前言 使用选育出的用于酒精发酵的酵母菌株酿造葡萄酒是现在普遍使用的一种方法。酵母对葡萄酒的质量尤其是口味有很大的影响（ 现代的酿酒学家发现用不同的酵母菌株发酵可以使葡萄酒产生不同的特点。这导致了具有多种特色并可以应用于不同领域的选育菌株工业生产化。现在市场上提供了几百种葡萄酒菌种，它们几乎都属于酿酒酵母菌属。 与此同时，人们对发明快速而且精确检测酵母菌株的方法也产生了兴趣。在葡萄酒酿造中，它的应用包括确定接种菌株对在未发酵葡萄汁中野生菌株的显性优势，实时记录发酵中的菌株动态过程，控制菌株生产的质量并鉴别无效菌株。酿酒时，选育出的菌株被接种于富含野生酿酒酵母和非酿酒酵母的葡萄汁中。快速鉴别酵母菌株的方法应该考虑到菌群生长动态的观察，选育菌株的显性优势和环境因素对酵母菌株的影响。在葡萄酒发酵，温度是影响酵母动力学的一个主要因素（Fleet and Heard,1993）;生态研究也显示出了酿酒酵母菌株的不同行为。(Epifanio et al., 1999; Torijaet al., 2003). 事实上，酿酒商要求菌株的一个突出特点是能够在特定的温度下进行良好的发酵反应。 很多时候，在一个典型的发酵白葡萄，发酵温度应保持18摄氏度，但达到12-15 摄氏度也不少见，从而提高调味品酯的含量并减少高酒精形成。在此温度下，经常会发生发酵停滞，因此，在这种状况下，选育菌种的低温代谢能力和对野生菌种的显性优势备受重视。 在过去的几年中，研究侧重于用分子生物学方法进行菌株分化（Beh et al., 2006） ，如染色体分析法（Carle and Olson,1985; Blondin and Vezinhet, 1988）和限制性片段长度多态性（ RFLP ）分析mDNA （Querolet al., 1992） ，以及基于PCR的方法，其中包括内部转录序列（ ITS ）的核糖体DNA 测序（Montrocher et al., 1998） ，δ元件插入位点的多态性（Cameron et al., 1979;Ness et al., 1993） ，扩增片段长度多态性（ AFLP ）的（De Barros Lopes et al., 1999） ，随机扩增多态性DNA （ RAPD ） （Baleiras-Couto et al., 1996） ， 内含子剪接序列扩增（De Barros Lopes et al., 1996）及PCR内含的线粒体基因（Lo′ pez et al., 2003） 。 这些方法在关于分辨率和处理时间方面对经典生理学实验起到了增强作用，但是其中一些方法还有些限制条件，因为它们几乎不能应用于日常的分析中，或者当它们容易实施时，它们并不能在菌种水平上完全区分这些菌株。此外，在一些方法中，如δ元件分型和RAPD，其重现性取决于DNA模板的纯度和浓度。(Ferna′ ndez-Espinar et al., 2001; Beh et al., 2006)。这些缺点意味着花费大量时间和资金进行DNA清理步骤，在某些情况下还需要几步反应，以评估非重复性带型发生的可能性。 基于具有长度多态性的简单序列重复基因位点分散在整个基因组中，微卫星分析已成功地被用来区分酵母菌株（Field and Wills, 1998;Gonzalez Techera et al., 2001; Pe′rez et al., 2001;Hennequin et al., 2001; Malgoire et al., 2005）。最近，利用对具高度多态性的微卫星位点的多重PCR方法可以分离一系列商用酵母菌株 (Schuller et al., 2004;Bradbury et al., 2005; Legras et al., 2005)。微卫星位点PCR高辨别能力以及其稳定性和实用性使其成为区分酵母菌种最受欢迎的方法之一。这个方法用于常规检测的瓶颈发生在扩增子分析的步骤：利用聚丙烯酰胺凝胶及测