荧光定量PCR步骤【2014-12-24】预案.docVIP

荧光定量PCR步骤 一．土壤基因组DNA提取 （一）试剂和仪器： 乙醇(96%-100%) 异丙醇 离心机 漩涡振荡器 水浴锅 电子天平 超净工作台 1000ul、100ul移液枪；灭菌枪头 1.5ml灭菌离心管、2ml灭菌离心管 称量纸、称量勺、滤纸、酒精棉球、镊子等 （二）提取步骤（OMEGA试剂盒 E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit）： 提取前准备工作：按说明书的比例用乙醇稀释SPW Wash Buffer。 打开水浴锅预热70℃（70℃预热Elution Buffer），用1.5ml离心管，取0.5g土壤，加入0.5g玻璃珠，加入1ml Buffer SLX MLus，立即在涡旋仪上最高速涡旋3min，使菌体进入溶液（豆粕的改为：打开水浴锅预热70℃，取3g豆粕到50mL离心管中，加入27mL水，3000rpm离心5min，重复3次各取4mL上清到5mL离心管，13000rpm离心2min，弃上清，加0.5g玻璃珠，加1mL Buffer SLX MLus，立即在涡旋仪上最高速涡旋3min，使菌体进入溶液）； 加入100ul Buffer DS，涡旋混匀； 转移至预热至70℃水浴锅中水浴10min，水浴过程中轻轻翻转一次（若存在较难溶解的细菌，水浴温度可增加到90℃），使菌体裂解； 3,000 rpm室温离心3min，转移800ul上清液到新的2ml离心管中，并加入270ul Buffer SP2涡旋混匀；（离心时准备冰盒） 置于冰中5min，13,000 xrpm、4℃离心5min（配平）； 在超净台中把上清液转称至新的2ml离心管中，加入0.7倍（749ul）的异丙醇，翻转混匀20-30次，把样品置于-20℃ 1h； 13,000 rpm、4℃离心10min，沉淀DNA（可能看不到沉淀）； 倒弃上清液，并反扣于吸水纸上1min, 若还有残留，则在超净台中用移液器吸去； 加入70℃预热的200 ul Elution Buffer，涡旋10s，65℃水浴15min，让DNA充分溶解（如果想得到不含RNA的DNA，在这一步向样品中加10ul 25mg/mL的RNA酶A）； 用剪过的黄枪头加入50ul HTR Reagent(使用前充分摇匀)，漩涡混合10s; 置于室温2min，13,000 rpm离心2min, 使HTR Reagent沉降； 转移上清液至新的2ml离心管（若经HTR Reagent提取后样品仍然显棕色或深色，重复步骤10-12）； 加入与上清液等体积（约200ul）XP2 Buffer, 漩涡震荡充分混匀； 将上步所得溶液加到吸附柱（柱子套在2ml收集管中），12,000 rpm 室温离心1min，弃上清液，保留收集管； 柱子重新套在上步收集管中，加入300ul XP2 Buffer，12,000 rpm 室温离心1min，弃上清液和收集管； 柱子套在新的2ml收集管中，加入700ul SPW Wash Buffer（经乙醇稀释），12,000 rpm室温离心1min，弃上清液，保留收集管； 柱子重新套在上步收集管中，重复步骤16； 柱子重新套在上步收集管中，13,000 x g 室温空离2min，使吸附柱干燥（空离完后在超净台中开盖晾干2min。该步对去除乙醇残余至关重要，乙醇残留可能会影响下游酶的使用）； 把柱子置于新的1.5ml离心管，枪头不要碰触吸附柱，垂直悬空加加30ul Elution Buffer至吸附柱中央，65℃水浴15min， 13,000 x g离心1min，洗提回收DNA； 换个1.5ml离心管，重复上步（不需要水浴）； 将两次得到的DNA溶液合并后再分装两管，每个30ul，一个放4℃常用，另一个-20℃低温储存。 用微量之外分光光度计测定提取的DNA浓度，OD260/OD280约为1.8左右，过低有蛋白质和酚污染，过高有RNA存在。 二．琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA产物（1%琼脂糖凝胶） （一）试剂和仪器 EDTA、NaOH、Tris、乙酸 EB 琼脂糖 10ul移液枪 电泳槽 电泳成像系统 （二）药液配制 50×TAE缓冲液（pH8.3）：称取Tris 242g，Na2EDTA2H2O 37.2g，向烧杯中加800ml的去离子水，充分搅拌溶解；加入57.1mL乙酸，使用去离子水定容至1L，高压灭菌后保存于室温。 1×TAE缓冲液：例如需要使用200ml的1*TAE，则量4ml的50*TAE，196ml的去离子水，混匀即可。 （三）步骤 制备1%琼脂糖凝胶（大胶用60ml,小胶用30ml）: 称取0.6g（0.3g）琼脂糖置于锥形瓶中,加入60ml（30ml）1×TAE，该上盖子。微波炉加热煮沸，煮沸后转两圈取出摇匀，重复一次，至琼脂糖全部融化，摇匀。用水