动物细胞转染知识大全.docVIP

转染 　　转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。 转染方法的分类 　　对外源基因转染方法的要求包括：转移效率高，不影响细胞正常生理活动，低毒性，容易使用，重复性好，易获得稳定转化子. 　　根据转染的机制不同可划分为化学转染法和物理转染法两大类. 化学转染法 　　1.DEAE-葡聚糖法 　　DEAE葡聚是最早应用哺乳动物细胞转染试剂之一，DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物，它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取，用DEAE-葡聚糖转染成功地用用于瞬时表达的研究，但用于稳定转染却不是十分可靠。 　　2.磷酸钙法 　　磷酸钙法是磷酸钙共沉淀转染法，因为试剂易取得，价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定转染的研究，先将DNA和氯化钙混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，最后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过细胞胞膜的内吞作用摄入DNA。磷酸钙似乎还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保护外源DNA 免受降解. 　　3.人工脂质体法 　　人工脂质体法采用阳离子脂质体，具有较高的转染效率，不但可以转染其他化学方法不易转染的细胞系，而且还能转染从寡核苷酸到人工酵母染色体不同长度的DNA，以及RNA,和蛋白质。此外，脂质体体外转染同时适用于瞬时表达和稳定表达，与以往不同的是脂质体还可以介导DNA和RNA 转入动物和人的体内用于基因治疗。人工合成的阳离子脂质体和带负电荷的核酸结合后形成复合物，当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质，随后DNA 复合物被释放进入细胞核内，至于DNA 是如何穿过核膜的，其机理目前还不十分清楚。 物理方法 　　1.显微注射显微注射虽然费力，但是非常有效的将核酸导入细胞或细胞核的方法。 　　2.电穿孔 　　这种方法常用来制备转基因动物，但却不适用于需要大量转染细胞的研究。电穿孔法常用来转染如植物园生智体这样的常规方法不容易转染的细胞。电穿孔靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞内。导入的效率与脉冲的强度和持续时间有关系。 　　3.基因枪法 　　基因枪依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导入细胞内，这种方法适用于培养的细胞核在体内的细胞。 [罗氏推荐]如何提高转染实验成功率 【组织培养试剂】 一般提示：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并经可能减少所用试剂的变更。 基础培养基—目前所使用的各种市售培养基（如，RPMI 1640和DMEM）。培养基的成分包括营养物质（氨基酸，葡萄糖），维生素，无机盐和缓冲物质。有些成分非常不稳定，因此如果不在使用时新鲜加入就可能会产生问题。务必要使培养基避光保存。因为已知有一些组分和缓冲物质，如HEPES，当暴露于光照下就会分解产生细胞毒性物质。 酚红试剂可保护细胞免受一些HEPES降解所产生的毒性效应，但在使用未加酚红试剂的培养基的应用场合下，如荧光素酶的测定，细胞毒性则仍然是一个问题。 胎牛血清—血清是一种含有白蛋白、球蛋白、生长促进因子和生长抑制因子的极为复杂的混和物。采集血清所用动物的年龄、营养水平、和健康状况可影响到血清中这些成分的数量和质量。因此血清易受显著生物学变异的影响。 添加剂—某些细胞的生长依赖于一些对生命力或细胞分裂必不可少的物质（如，生长因子，微量元素，必需代谢物和蛋白等）。 CO2培养箱—细胞生长所需环境为37℃、相对湿度为95％的CO2培养箱。用CO2是为了控制pH值。细胞生理对pH的变化非常敏感，因此多数细胞培养基都含有碳酸氢盐缓冲体系。有些培养基需要CO2浓度为5％来有效控制pH值，而另一些则需要10％的CO2。需要向您的培养基供应者核对一下适当的CO2浓度。如果培养箱内培养条件与所需条件不一致（温度、湿度和CO2）则会导致实验结果的板间变异性。来自于培养箱内的污染物、化学物质，或真菌／细胞的污染也都可能影响到细胞生理。 【细胞】 一般提示：密切观察您的细胞；确保它们状态良好。在开始转染细胞之前，先制定一个适当的种板方案，使细胞密度从转染开始到结束都保持最佳状态。 增加成功几率—细胞是转染过程中的一个关键元素，它可以是影响结果的一致性和质量的最重要的变量。 分裂细胞相比较非分裂细胞—分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于生长过度的状态。由于FuGENE? 6和HD转染试剂对于细胞作用温和，可同时进行贴壁细胞的种板和转染。此外，还常用促有丝分裂刺激物（如，病毒转化，生长因子，条件培养基，以及滋养细胞）来活化原代培养细胞。 贴壁细胞相比较悬浮细胞—在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。天生趋于悬浮的细胞（如HL 60，Jurkat）