定量PCR方法辩析.pptVIP

实时荧光定量PCR方法总结 (Real time Quantitative PCR) 内容 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR大致步骤 注意事项 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，荧光基团可与双链DNA结合发出荧光而在游离时不发光，随着DNA扩增荧光信号逐渐增强，通过测定荧光信号强度实时监测整个PCR进程。 荧光扩增曲线可以分成四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期和平台期。只有在指数增长期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，所以选择在这个阶段进行定量分析。 一些术语 实时荧光定量PCR大致步骤 提取RNA： 用剪刀剪下50-100mg组织放入2ml离心管中，加入1ml Trizol匀浆，一般5-10s即可（匀浆机使用前须用0.1% DEPC溶液浸泡，检查刀口是否有残留组织）。然后加入氯仿离心，取上清（勿吸入白色沉淀）加入异丙醇离心，弃上清用75%乙醇洗涤沉淀，晾干后加入DEPC水（由0.1%DEPC溶液经高压制得）溶解，然后尽快反转录，如要长期保存则放入液氮或超低温冰箱。 离心管不能用记号笔标号，可用铅笔。 检测及稀释 用微量分光光度计测定RNA溶液的纯度（OD260/OD280要在1.8~2.0之间）和浓度，然后将各样品RNA稀释至统一浓度（如1μg/μL）。 如果要电泳检测RNA完整性，最好采用甲醛变性凝胶电泳。 反转录 按试剂盒说明书，将除模板RNA外的所有试剂加在一个1.5ml离心管中，然后混匀后分加到各0.2 ml离心管中，并且大约每10个样需多制备一个样的混合液。最好采用20μL体系。之后定量的混合液也需按此操作。反转录获得cDNA之后可分装后-20℃长期保存。 引物设计 登录，搜索目的基因mRNA序列（可能不止一个），然后用primer premier 5.0软件设计引物，根据各项参数可对设计的引物进行适当调整。大连宝生物公司（Takara）免费提供引物设计服务，但不是绝对能设计出来。 示例 primer premier 5.0软件设计引物流程 打开软件，点击File→New→DNA Sequence，弹出如下对话框。 点击Search，弹出右边对话框，可设置引物搜索条件，然后点击OK，又弹出一对话框，再点OK。 得到搜索结果，一般评分越高，左下无Found，引物对越好，然后根据各项参数决定是否对引物对进行编辑调整。 PCR后电泳检测 可用普通PCR也可用实时荧光定量PCR（较贵）扩增cDNA，然后用2%琼脂糖凝胶电泳检测产物。如要制作标准品则将产物条带割下，然后用纯化试剂盒对凝胶进行纯化。如不立即做则将凝胶于-20℃保存。 实时荧光定量PCR 按试剂盒说明书操作。采用ABI 7300定量PCR仪，用八联管跑定量较方便，使用前注意检查管壁是否完好。 ABI 7300定量PCR仪操作程序 添加引物名称到右边方框中，如已有引物中没有所需引物名称则新建一个。 设置反应孔的名称、类型（标准品、样品、NTC）、编号以及标准品的浓度 。 设置反应程序、反应体积，点击添加溶解曲线，然后File→保存在文件夹中，最后点击Start。 如果要去掉某个步骤则双击它，点击Delete。 查看结果 较好的线性图谱呈S形，下面的对数图谱曲线断开是由于基线设置的3-15，所以从接近15处断开。 标准曲线斜率应在-3.9~-2.9间，尽量接近-3.32，R20.98，尽量接近1。 溶解曲线应只有一个单峰。如果出现两个以上的峰说明有非特异性产物或引物二聚体产生，需要调整反应程序或更换引物。 样品CT值一般控制在15~35之间。如果CT值太大则说明模板浓度太低，需加大模板量；如果CT值太小则可稀释模板。 原则上每个样品需要做2-3个平行孔，平行孔间CT值差值不能大于1。 定量方法 分为绝对定量和相对定量。绝对定量测定模板的精确拷贝数，通常需要用一系列已知拷贝数的标准品制作标准曲线，标准品主要是纯化的质粒DNA，制备复杂；而相对定量只测定模板的相对量而不测定其具体拷贝数，比较不同样本间的倍数关系。 相对定量测定方法包括两种：双标准曲线法和比较CT法（2-△△CT）。其中双标准曲线法类似于绝对定量，只是所用的标准品可用cDNA或PCR产物等，不需要知道其具体拷贝数，只要知道其稀释梯度即可。 两种相对定量方法的比较 注意事项 试验前详细了解试验步骤，试验材料准备齐全并适当处理，如DEPC浸泡、高压、干烤、酒精棉球擦拭等。 试验过程中一定要戴手套，最好戴2层，并注意更换。大部分试剂都是有毒物质，如焦炭酸二乙酯D