52《多聚酶链式反应扩增DNA片段》_培训课件.pptVIP

10、精确复制的原因 11、复制的意义 DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性 ①规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板 ②碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行 ①一条双链DNA分子，复制N次，形成的子代DNA分子中，含亲代DNA母链的有两个DNA分子，占子代DNA总数的2/2N；亲代DNA分子母链两条，占子代DNA中脱氧核苷酸链总数的2/2N+1= 1/2N ②设一条DNA分子中有胸腺嘧啶为m个，则该DNA复制n次后，形成子代DNA分子需游离的胸腺嘧啶为T=(2N-1)m 12、DNA复制过程中的等量关系 聚合酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction) Kary B. Mullis PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。 利用PCR技术扩增 ① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 ③条件：_______________________、 _______________、___________ 、 ___________.前提条件： ②原理：__________ ④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数） ⑤结果： 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 已知基因的核苷酸序列 四种脱氧核苷酸 一对引物 DNA聚合酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 PCR(多聚酶链式反应） 1、 DNA聚合酶特性 不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此， DNA复制需要引物 2、 DNA聚合酶作用过程 当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸 利用PCR技术扩增 二。PCR技术扩增过程 a、D变性（94）：双链DNA模板 在热作用下，_____断裂，形成___________ b、复性（复性55℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（72℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 PCR反应过程可分为三步：变性、复性（退火）、延伸 1．变性 双链模板DNA解离为单链结构。（90～95℃） DNA 双链 DNA 单链 变性 2．退火 （复性） 引物与模板互补成双链。 （50～60℃） (由于引物浓度高，序列短，所以易与模板结合。) PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸 引物 PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸 3．延伸 在Taq酶作用下，合成特异DNA序列。70～75℃ 延伸 变性 第二次循环 延伸 第二次循环 模板来自于 / * 模板来自 / * * 是基因工程中获取目的基因的最常用的一种方法，也是当今分子生物学实验工作的基本方法之一。 * * 模板来自于 * * 注意： 1.PCR-mix的成分包括了dNTP、Mg2+、buffer 加入试剂的顺序，最好从量大到量小的顺序 2.每取一种液体后都要更换枪头，以免污染 3．加入最后一个样品后，用枪头在PCR管内反复吸排几次，使其混合均匀。 4. 每个老师的PCR管上都要用记号笔标记，防止混淆。 5.样品都加好后，放入迷你离心机中离心10sec * 课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段 基础知识 1 PCR 的实验操作 2 课题成果评价 3 课题延伸 4 实验小结 5 Table of Contents 内容大纲 （一）DNA分子的结构 C、H、O、N、P 1、组成元素 脱氧核苷酸 2、基本单位 3、脱氧核苷酸结构 脱氧核苷酸 脱氧核苷 磷酸 脱氧核糖 含氮碱基 嘌呤 嘧啶 腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G） 胞嘧啶（C） 胸腺嘧啶（T） 一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二脂键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端 4、多脱氧核苷酸链的形成 脱氧核苷酸结构式 O O P O HO 碱基 O OH O O P O HO OH 碱基 5’ 3’ 3’ 5’ 碱基 脱氧核糖 磷酸基团 碱基 脱氧核糖 碱