2012生化实验幻灯片.pptVIP

2012生化实验 实验安排 胰酶提取 第一天 新鲜猪胰脏1个 冰浴下剥除脂肪和结缔组织 粉碎胰脏 加100ml巳预冷却的pH2.5-3.0乙酸酸化水溶液提取 检查提取液中PH，若高于pH3.0时应及时用10％乙酸调节，使提取液维持在PH2.5-3.0之间 在冷室5℃左右搅拌提取18—24h 卵清蛋白分离提取 第二天 布氏漏斗抽滤（或离心），得黄绿色清液 加入4℃预冷的丙酮200 ml 在4℃放置2 h之后， 弃上部丙酮液，下部沉淀部分于10000 rpm离心5 min 收集沉淀 沉淀溶于10 ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4 h，换水两次 再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜 亲和层析柱材制备 Sephadex-G75的活化及偶联 2.5g干重的葡聚糖凝胶Sephadex G一75，溶胀洗涤数次 加入0.05M Nal04溶液50ml，30Min， 蒸馏水洗涤数次，抽干备用 纯化的鸡卵粘蛋白35ml，加入活化葡聚糖凝胶 5％K2C03、调pH7.5—9.0，缓慢搅拌3h， 随时用5％K2CO3保持pH的稳定 0.27gKBH4溶于20ml水，缓慢搅拌加入上述体系，反应5h，pH维持在6.5—7.5 洗涤 基因组DNA提取 高温裂解（抑制DNase，促进其它分子变性，促溶）； 试剂：NaCl, SDS, EDTA, Tris-HCl pH7.5； 试验材料： 微生物菌体； 质粒DNA提取 PPO提取、纯化 感受态细胞制备 感受态，就是细菌吸收转化因子（周围环境中的DNA分子）的生理状态 制备高效转化的感受态细胞的方法是： 在冰浴中，用一定浓度的CaCl2处理对数生长期的细菌。也有采用Rb+、Mn2+、K+、二甲亚砜、二硫苏糖醇（DTT）或用氯化已胺钴处理制备感受态细胞。 转化 　　细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一个细菌菌株的DNA，而导致外观形态特征和某些行为特征发生遗传性改变的生命过程。 热激后，受体菌温浴目的－，使其表达足够蛋白，以便能在含抗菌素的琼脂培养板上生长菌落。 　　重组质粒DNA转化不同的受体菌，有着不同的转化效率。　　重组分子越大，转化效率越低。如果应用较大的基因片段制备基因文库，困难较多，成功率较低。 在100ng/100μl以下的DNA浓度范围内，转化效率与DNA分子数成正比关系。　　 重组DNA分子没有甲基化－选用限制系统即酶缺陷型菌株。防止重组DNA被菌体内酶降解 * * Western 转化、SDS、电转 连接、亲和层析 连接、感受态细胞制备 酶切、感受态细胞制备 酶切、亲和层析 亲和层析柱材制备、染色体、质粒DNA提取 第五-七天 PPO活性、蛋白浓度测定 PPO提取、纯化 第三-四天 粗胰酶提取卵清蛋白提取 第二天 粗胰酶提取、卵清蛋白提取 第一天 1 第2天 4层纱布过滤，取滤液 50m1pH2.5乙酸酸化水抽提残渣一次(时间约为1一2h) 合并滤液，用乙酸溶液调正pH至2.5-3.0 放置3—5h后，，取上清，量其总体积 盐析：加固体粉状硫酸铵，至40％饱和度 盐析1hr 12000rpm 离心 10min 上清液加硫酸铵，至75％饱和度 盐析1hr 12000rpm 离心 10min 沉淀 溶于10ml pH7.5, 0.1 MTris 透析过夜，4 ℃保存 第一天 新鲜鸡蛋两只 取蛋清50 ml 温水浴25℃～30℃ 加入等体积的三氯乙酸－丙酮（1:2V/V） 最终pH约3.5 再继续搅拌30 min 4℃放置过夜 第三天 10000 rpm离心10 min,取上清液 再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜 第三天 10000 rpm离心10 min,取上清液 检测： 电 泳 0.5~0.6％ARGAROSE； 比 色 50ug/ml DNA; OD260/OD280=1.8， 40 ug/ml RNA; OD260/OD2801.8 培养好的菌液1.5 mL， 离心收集菌体 600ul 65℃ 预热的细胞裂解液，悬浮菌体 加入60ul 酚滚动混匀，65℃，30min 加入600ul氯仿混匀，静置4～5min，离心 取上清 等体积氯仿抽提一次 0.1V 3M NaAc（Ph5.2）、2V乙醇，－70℃20 min沉淀DNA 70％酒精洗涤沉淀DNA，真空干燥 沉淀溶于40-100μL无菌水 细菌质粒的提取 ①细菌培养物的生长：选择压力LB培养基中生长到对数晚期 ②细菌的收获和裂解： 碱变性抽提的原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。