单克隆抗体制备方案.docVIP

单克隆抗体制备方案 细胞融合前准备 一、动物免疫 1.1 动物 选择与所用骨髓瘤细胞同源的纯系Balb/c小白鼠，雌雄皆可，鼠龄8周左右。为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。 1.2免疫原制备　 15ml离心管15个、50ml离心管7个、10ml注射器5支、Tip头20个、电子天平、CFA、PBS、CFA（使用前需震摇） 50μg /只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入7mlPBS中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射器反复推吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4℃保存。 100μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入3mlPBS中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射器反复推吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4℃保存。 150μg/只：称取90mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入2mlPBS中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射器反复推吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4℃保存。 200μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入1mlPBS中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射器反复推吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4℃保存。 250μg/只：称取100mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入1mlPBS中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射器反复推吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4℃保存。 1.3 实验步骤 初次μg、100μg、150μg、200μg、250μg抗原溶于PBS中，加等体积的福氏完全佐剂（CFA1ml，0.2ml/点 3周后 第三次免疫：与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加IFA，腹腔和皮下注射，5天后内眦静脉或断尾取血以ELISA间接法测效价 2～～腹腔注射 大鼠、小鼠一般一人即可注射：以左手大拇指与食指执住鼠两耳及头部皮肤，腹部向上，将鼠固定在手掌间，必要时，以左手无名指及小指夹住鼠尾；右手持连有5号针头的注射器，将针头从下腹部朝头方向刺入腹腔，回抽无回血或尿液，表示针头未刺入肝、膀胱等脏器，即可进行注射。 进行腹腔注射时应注意： 1、针头刺入部不宜太近上腹部或太深，以免刺破内脏。 2、针头与腹腔的角度不宜太小，否则容易刺入皮下。 3、用的针头不要太粗，以免药液注射后从注射孔流出。注射后用棉球按一下注射部位。 4、为避免注射后药液从针孔流出，也可在注射时先使针头在皮下向前推一小段距离，然后再刺入腹腔。 皮下注射 皮下注射较简单，一般都取背部及后腿皮下。注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入，固定后即进行注射。 注射器针头不易进入，硬进容易折断针头，故给这些动物作皮下注射时不应选背部皮肤。 一般狗、猫多在大腿外侧；豚鼠在后大腿内侧或小腹部；大鼠可在侧下腹部。兔在背部或耳根部注射。 1.4 注意事项 ①免疫时抗原的剂量应根据其免疫原性制定，若免疫原性较弱，需在50～100μg基础上增加。 ②商品化的福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。皮下注射给药皮下注射给药是将药液推入皮下结缔组织，经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环的过程。作皮下注射常选项背或大腿内侧的皮肤。操作时，常规消毒注射部位皮肤，然后将皮肤提起，注射针头取一钝角角度刺入皮下，把针头轻轻向左右摆动，易摆动则表示已刺入皮下，再轻轻抽吸，如无回血，可缓慢地将药物注入皮下。拔针时左手拇、食指捏住进针部位片刻，以防止药物外漏。4%的台盼蓝母液：称取台盼蓝，加少量蒸馏水研磨后，再加蒸馏水至，用滤纸过滤，℃保存使用时用的PBS稀释至0.4％RPMI-1640培养液 2. 试验步骤 ①加强免疫3天后摘除眼球放血，收集血清留作阳性对照静30～60min后，将血块轻轻剥离管壁，000r/min离心min，吸取上清（血清）4冰箱备用。浸泡于75％酒精中消毒用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，打开腹腔，脾脏不完全RPMI-1640培养液，于无菌平皿中过不锈钢筛网用注射器针芯成细胞悬液用重悬计数活细胞：把细胞悬液稀释到个/ml将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片