原位杂交手册.docVIP

第1章 共用程序 引 言： 本章介绍了本实验最基本的实验程序，包括中期染色体制片；质粒的转化与DNA的提取；探针标记检测以及基因组总DNA的提取 第1节 原生质体染色体制片 试 剂： 饱和a-溴萘、0.075MKCl、固定液（新鲜3：1甲醇冰乙酸）、酶解液（20%纤维+2%果胶酶）、IN HCl、95%酒精 实验步骤： 浸 种 室温下浸种约一天（也可1-2h） 发 芽 培养皿中垫湿滤纸三层，利子分散其上，间留间隔，勿堆积，种子上层覆盖一层水浸湿的滤纸，25-30℃下发芽，每天水洗一两次，约2-3天可取根。 NOTE：换水是很重要的，水不能过多，以不留流动水为好，水分过多易长芽而根长不好。 预处理 方法1：根长至1.5-2cm长时切取1.5mm 左右的根尖，饱和a-溴萘约25℃处理2-3小时，水稻一般不预处理。 方法2：根长好后将种子置于4℃冰箱处理一个晚上，第二天在25℃下恢复2-3h，也可得到许多分裂相。 NOTE：何进取根尖最好具随机性，与季节以及细胞分裂时期很有关系。（玉米8:00AM，水稻11:00-12:00AM） 水 洗 反复几次 前低渗 ddH2O或0.075M KCl（0.6KCl溶于100ml ddH2O）低渗30min（室温）。 固 定 新鲜3∶1甲醇冰乙酸固定2-3小时或4℃过夜。 NOTE：一定要用新鲜固定液；如果用于石蜡切片组化显色，甲醇固定的材料会导致很高背景，应换用4%多聚甲醛。 水 洗 反复几次，洗净。 酶 解 2%纤维素酶+2%果胶酶混合（1∶1），28℃下处理3小时左右。 NOTE：酶解是最至关重要的一步，首先是酶的质量，很多酶都可导致分裂相少，以SERVA公司的果胶酶为最好，根据材料不同，酶解时间会有所变化。 洗载片 载片一定要干净，以防材料脱落和保持清洁的背景。 洗片步骤： 1）IN HCl中3min以上 2）自来水洗（每片单独漂洗）接着用双蒸水洗 3）95%酒精浸泡30min以上（每片单独放入） 制 片 小心吸去酶液，水洗几次，吸取1-2个根尖于干净的干载玻片上，滴半滴固定液，用镊子敲至浆状，滴2-3滴固定液使材料分散，火烤至着火。 NOTE：敲得越碎越好，敲至固定液干后，再滴固定液，迅速涂开，火焰干燥，干燥后肉眼观察应为规则干净的小雨点状，若小雨点上像有一层不透明的薄层，说明酶解时间不够。 镜 检 检后将符合要求的制片储存于-20℃下备用。 NOTE：每张制片上至少应有150个左右分散良好但背景干净的分裂相方可用于杂交。 REFERENCES 第2节 质粒的转化与扩增 若寄来的探针是插在质粒中cDNA克隆或基因片段，首先要对其进行转化，一般利用E.Coli 作为载体，转化的关键在于如何制备感受态的 E.Coli细胞，本实验利用 CaCl2来制备感受态细胞，此方法简便、快速。 试 剂： LB培养基，0.1M Cacl2，70%甘油 实验步骤： 感受态E.Coli的制备 从-20℃下取2-5μl E.Coli，涂在平板上，37℃培养16-20h。 挑取单个菌落于20ml已预热至37℃的LB培养基(不含Amp)中，37℃，300rpm剧烈振摇约3h。 培养物转移至4支预冷的5ml Eppendorf管,冰上放10min，4000rpm离心 3-5min，回收细胞（4℃）； 倒出培养液，倒置lmin。 以5ml预冷的0.1M Cacl2重悬每份沉淀，冰浴30min。 4000rpm离心5min（4℃）；倒出培养液，倒置lmin。 每管加预冷的0.1MCaCl2 0.25ml，重悬细胞，冰浴lh 每管100μl分装,保存于-20℃下,长期保存转化效率会有所下降。 质粒DNA的转化 取-20℃保存的感受态细胞二支，冰上溶解10min，一支加质粒cDNA(10μl，30ng)，混匀，另一支作为对照，冰浴30min。 42℃水浴放置90秒，保持1-2min。 快速置于冰浴，保持1-2min。 每管加200-300μl培养基，用水浴加热至37℃ 。 37℃摇床温育45min。 扩 增（无菌操作） 将温育后的转化细胞转移至含抗生素（100μg/ml LB）的LB平板上。 当液体被培养其吸收后，倒置平板，37℃培养12-16h，时间不宜过长。 菌落生成后，挑取单个菌落，37℃于LB液体培养基中培养24h左右。 加70%甘油，-20℃保存。 第3节 质粒DNA的提取 试 剂： LB固体培养基，LB培养基，Sol.Ⅰ，Sol.Ⅱ（当配当用），Sol.Ⅲ，Sol.VI，异丙醇，70%酒精，RNaseA，100%EtOH，TE溶液 实验步骤： 活 化 含重组质粒细菌用划线法接种在LB固体培养基上，37℃培养箱培养过夜。 扩 增 挑