实验双缩脲法测定蛋白质含量.pptVIP

?基本原理： 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 考马斯亮蓝染色法 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高10－100μg （比Lowry法灵敏4倍）。 Coomassie Dye-Based 蛋白质定量 PROTEIN + Amax = 595nm BLUE Acid Coomassie G-250 Protein - Dye Complex O CH 2 CH 3 NH C CH 3 CH 3 N CH 2 SO 3 - CH 3 CH 2 N CH 2 CH 2 CH 3 SO 3 Na + 蛋白质含量的测定 紫外吸收法 双缩脲法 Folin-酚法 考马斯亮蓝法 检测 波长 280 nm 540 nm 650 nm 595 nm 检测 范围 0.1-1.0 mg 1-10 mg 25-250μg 10-100 μg 繁琐 程度 简便 较简便 较简便 较简便 应用 纯度高样品 快速但不十分精确 受多种因素干扰 干扰较少 本次实验采用双缩脲法测定蛋白质含量 一、操作步骤 1.取15支试管，按下表编号、加试剂（做2个平行组） 管号 0 1 2 3 4 5 6 样品 牛血清白蛋白(mg) 0 0.6 1.2 2.4 3.6 4.8 6.0 2mg/mL牛血清白蛋白体积(mL) 0 0.3 0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 － 待测液体积(mL) － － － － － － － 3.0* （取2个不同体积） 蒸馏水(mL) 3.0 2.7 2.4 1.8 1.2 0.6 0 0 OD540 2.各管混匀后，加入双缩脲试剂3.0mL，37oC反应30min。 3.以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。 二、结果处理 1.绘制标准曲线 以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制标准曲线。 2.样品的计算 根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（mg），再根据样品的体积计算出样品的浓度。 三、注意事项 1.须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。 2.样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。 3.用坐标纸绘制标准曲线，注明轴名称及单位。 4.比色杯的使用 微量移液器的使用 返回 吸液：调好量程后，用大拇指将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点，吸取所需液体。 排液：接着将按钮按至第一停点，排出液体 排出残液：稍停片刻继续按按钮至第二停点，吹出残余的液体。最后松开按钮。 设定量程时，切忌使移液器量程旋钮超出其标示的最小和最大量程。 在将枪头套上移液器时，切忌使劲地用枪砸枪头盒。 正确的方法是将移液枪（器）垂直插入枪头中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合。 吸液时，要轻推轻吸，切忌将样品吸入移液器腔内。当移液枪头里有液体时，切忌将移液器水平放置或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。 使用完毕，把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧，竖直挂在移液枪架上。 移液器使用注意事项 * 我 * 我 * 我 * 我 * 我 * 我 * 我 实验 双缩脲法测定蛋白质浓度 实验目的 1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习蛋白质含量测定的原理和方法 3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法 原理：物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。根据物质对光的吸收特征和吸收强度，对物质进行定性和定量的分析方法，常用紫外—可见分光光度法。 光的电磁波性质 ? ?射线 x射线 紫外光 红外光 微波 无线电波 10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm 可 见 光 分光光度法 定性分析与定量分析的基础 物质对光的选择吸收 A ? 在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。 A ? C 增大 定性分析基础 定量分析基础 I0 I 参比 样品 入射光 I0 透射光 I 一束单色光通过溶液介质后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。 在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。 Lambert—Beer定律 A=εCL T（透射比）=I/I0=10-?CL lg(1/T)= ?CL A为吸光度；ε为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度 应用 （1）比较吸收光谱曲线