吸入异氟烷对大鼠肺表面活性蛋白-A(SP-A)的影响.docVIP

吸入异氟烷对大鼠肺表面活性蛋白-A（SP-A）的影响 李志红1 杨拔贤2 安海燕2 （1 北京肿瘤医院麻醉科，北京，100036；2北京大学人民医院麻醉科，北京，100044） 摘 要 目的 观察大鼠吸入不同浓度异氟烷时，肺表面活性蛋白-A(SP-A)的含量及其基因表达的改变。 方法 雄性Wistar大鼠104只随机分为5组：组1，空白对照组（Con，n=8）；组2，40% O2对照组（40% O2，n=24）；组3，0.7%异氟烷组（0.7%Iso，n=24）；组4，1.5%异氟烷组（1.5%Iso，n=24）；组5，2.0%异氟烷组（2.0%Iso，n=24）。其中组2吸入40% O2，组3、4、5大鼠分别吸入设定浓度的异氟烷（载气为40%O2）。除空白对照外，其余各组再分为三个亚组：4小时组（4hr，n=8）、8小时组（8hr，n=8）和10小时组（10hr，n=8）。4hr和8hr亚组分别吸入各组气体4小时和8小时，组2中10hr亚组吸入40% O2 10小时，3、4、5组中10hr亚组分别吸入设定浓度异氟烷8小时，停药后再吸入40% O2两小时。于设定时间点迅速处死实验大鼠，取肺组织透射电镜观察肺泡Ⅱ型上皮细胞结构变化；检测支气管肺泡灌洗液中SP-A的含量（Western Blot）；Ⅱ型上皮细胞中SP-A的含量（IHC） 异氟烷（isoflurane，Iso）由于具有安全、低毒和可控性好等优点，而成为目前临床最常用的吸入麻醉药。但是，其对呼吸系统，尤其是对肺泡上皮细胞的不良影响也已为人们所重视。有动物实验表明，异氟烷可以降低肺表面活性物质(pulmonary surfactant, PS)的合成（包括磷脂和蛋白），增加肺部的炎性反应并降低肺部的防御机制，［1-5］　是引起术后肺部并发症(如肺不张、肺部感染等)的影响因素之一。而肺表面活性蛋白-A（surfactant protein A, SP-A）是肺表面活性物质中含量最多，与PS的合成和分泌密切相关的一种蛋白质，并对PS的生理功能和肺自我防御机制起到重要作用［6-7］。有研究表明，大鼠吸入较高浓度异氟烷时，支气管肺泡灌洗液中的SP-A浓度下降。［8］异氟烷还可使培养的正常Ⅱ型肺泡上皮细胞内和培养液中SP-A的含量降低。［5］　然而，吸入异氟烷引起上述改变发生在哪一水平，目前还未见明确报道。因此，本实验研究拟通过检测吸入不同浓度异氟烷大鼠的支气管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid, BALF)和肺组织中SP-A的含量，以及肺组织中SP-AmRNA含量的变化，来探讨异氟烷对肺内SP-A的合成、分泌与基因表达的影响。 材料与方法 (一)实验动物: 健康成年Wistar大鼠104只，体重200±10g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，于北京大学人民医院实验动物中心（SPF级）预检7-10天，六只一笼饲养，动物室和实验室温度为23oC，12h明暗轮流光照，自由饮食。 (二)试剂与药品: 异氟烷（美国雅培制药有限公司） 戊巴比妥钠（德国默克制药公司） 40% Acrylamide（丙烯酰胺:N, N’－双丙烯酰胺 = 29:1，美国Bio-Rad公司）； N，N，N’，N’－四甲基乙二胺（TEMED，美国Promega公司）； 标准分子量蛋白（Protein Molecular Markers，美国Biolab公司）； 标准浓度蛋白（美国Promega公司）； 蛋白分析液（美国Bio-Rad公司）； Tween-20（美国Bio-Rad公司）； 苯甲磺酰氟（PMSF，美国Sigma公司）； 正钒酸钠（Sodium Orthovanadate，NaVO4，美国Sigma公司）； 抑肽酶（Aprotinin，美国Sigma公司）； ECL化学发光试剂盒（英国Amersham公司）； 兔抗SP-A多克隆抗体（美国Santa Cruz公司，工作浓度1:200） 辣根过氧化物酶结合羊抗兔多克隆抗体（美国Santa Cruz公司，工作浓度1:2000）； LSAB试剂盒（丹麦Dako公司）； RNA提取试剂（Trizol））Oligo(dT)15、逆转录酶（美国公司）；Rnasin（公司）； 焦磷酸二乙酯（DEPC，美国Sigma公司）； Taq PCR MasterMix（包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2，浓度为2×）（北京天为时代公司）； 核酸分子量参照物： DNA marker公司）；琼脂糖（购自北京公司）；(三)主要仪器: Narcomed 2B 麻醉机 （Drager公司） 机玻璃麻醉箱（40cm×30cm×30cm）（北京有机玻璃厂） 气体监测仪 （Datex-Ohmeda，芬兰）