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2008-4-22 Vt=Vo+Vi+Vg Vt=πR2h=柱体积 Vo：等于被完全排阻的大分子的洗脱体积。可以用一个已知相对分子质量远超过凝胶排阻极限的有色分子，如常用的蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，即可测出柱床的外水体积Vo。 Vi：内水体积，可由g·Wr求得（g为干凝胶质量，单位为g，Wr为凝胶吸水量，以mL／g表示）。Vi也可以从洗脱一种完全不受凝胶微孔排阻的小分子溶质（如重铬酸钾）的洗脱体积Ve计算，Ve＝Vo＋Vi Vg：干凝胶体积 2008-4-22 洗脱体积Ve＝Vo＋Kd.Vi Ve包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积 Kd为每个溶质分子在流动相和固定相之间的一个特定的分配系数，它只与被分离物质分子大小和凝胶颗粒内孔隙大小分布有关。Kd可通过实验由Ve、Vo和Vi求得。 2008-4-22 Kd愈大，进入凝胶颗粒内的程度愈大；当0＜Kd＜l时，意味着溶质分子只有部分向凝胶颗粒内扩散。 Kd＝0时，Ve=Vo，说明这种溶质被排阻于凝胶颗粒之外而最先洗脱下来； Kd＝1时，即Ve小分子＝Vo＋KdVi，说明这种溶质完全向凝胶颗粒内扩散，在洗脱过程中将最后流出柱外。 实际上，约1/5的内水因溶剂化作用而呈水合状态，妨碍小分子的自由扩散。故实际上Ve小分子 ＝Vo＋0.8Vi； Kd = （Ve-Vo）/Vi 2008-4-22 三 、常用凝胶: 由于胶体溶液凝结而成的固体物质,其内部具有很微细的多孔网状结构.层析法中常用凝胶有: 1.天然: (1)马铃薯淀粉凝胶 (2)琼脂和琼脂糖凝胶 2.人工合成: (1)聚丙烯酰胺凝胶 (2)交联的葡萄糖凝胶 2008-4-22 （1）琼脂糖凝胶（agarose gel） 由琼脂中分离出来的天然凝胶，依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。 可分离相对分子质量108的大分子及病毒，但由于琼脂的强吸附作用，洗脱困难， 琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否则不能溶胀恢复原有形状。一般悬浮在l0-3 mo1/L EDTA和0.02%叠氮化钠溶液中。 2008-4-22 瑞典Sepharose，3种型号，即Sepharose 2B，4B和6B（同中国相同）。阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量。 美国Bio－GA，有6个型号，即Bio-G 0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。 英国Sagavac，又分为Sagavac 2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分数，F代表粉末状，C代表颗粒状。 丹麦Gelarose，有5种类型，即2％，4％，6%，8％和10％。 2008-4-22 （2）聚丙烯酰胺（Bio-Gel P) 人工合成凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。 交联剂越多，孔隙度越小。 不耐酸：pH2-11 2008-4-22 聚丙烯酰胺凝胶的结构 2008-4-22 商品聚丙烯酰胺为颗粒状干粉，有成块粘附倾向，在溶剂中自动溶胀成胶。 根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿拉伯数字表示，从Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）。 2008-4-22 （3）交联葡聚糖凝胶（Sephadex) 葡聚糖凝胶（Sephadex）具有良好的化学稳定性，是目前生化产品制备中最常用的凝胶。 葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大 。 2008-4-22 交联葡聚糖凝胶的化学结构 2008-4-22 G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度，也代表特水量： X数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。 X数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品 X数字也代表凝胶的持水量，如G-25表示1g干胶持水2.5mL，G-100表示 1g干胶持水10mL，依次类推 2008-4-22 四、凝胶层析的基本操作 1．层析柱的选择 层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱过长会引起柱子不均一、流速过慢等困难。一般柱长度不超过100 cm，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长