基因的克隆与表达.docxVIP

基因的克隆与表达基因基因(gene)这个名词是1909年由遗传学家约翰森(W.L.Johannsen,1857—1927)提出来的.他用基因这一名词来表示遗传的独立单位,相当于孟德尔在豌豆试验中提出的遗传因子.顾名思义,基因不仅是一个遗传物质在上下代之间传递的基本单位,也是一个功能上的独立单位.基因是DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称,是具有遗传效应的DNA(脱氧核糖核酸)分子片段.基因不仅可以通过复制把遗传信息传递给下一代,还可以使遗传信息得到表达,反映在蛋白质的分子结构上,从而使后代表现出与亲代相似的性状.1.结构基因(structural gene)是指某些能决定某种多肽链(蛋白质)或酶分子结构的基因.结构基因的突变可导致特定蛋白质(或酶)一级结构的改变或影响蛋白质(或酶)量的改变.2. 调控基因(regulator and control gene)是指某些可调节控制结构基因表达的基因.调控基因的突变可以影响一个或多个结构基因的功能,或导致一个或多个蛋白质(或酶)的改变.简言之,基因就是编码一段功能蛋白质的DNA序列及其调控序列.克隆是英文(clon)clone的音译 :指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体.无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合,只由一个生物体产生后代的生殖方式,常见的有孢子生殖,出芽生殖和分裂生殖.由植物的根,茎,叶等经过压条或嫁接等方式产生新个体也叫无性繁殖. 克隆就是一种以DNA重组技术为基础的人工诱导的无性繁殖方式.也称为分子克隆(molecular cloning)或基因克隆.DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作.克隆分,切,接,转,筛分,切,接,转,筛分:目的基因的获得1,PCR(RT-PCR)2,酶切PCR技术PCR:聚合酶链式反应 ( Polymerase Chain Reaction),是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用,通过变性-复性-延伸的循环操作,在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术.一,PCR基本原理:变性-复性-延伸1.变性:通常采用加热变性,即将模板DNA或延伸后的双链DNA加热到940C,使双螺旋DNA解开成为单链.2.复性:通过降低反应温度至500C- 650C ,使两种引物能与两条解开的DNA互补链的3`端粘合,以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3`-OH.3.延伸:将反应温度提高到约720C,在耐热DNA聚合酶的催化下,根据模板DNA提供的碱基顺序,合成两条互补链,从而使模板DNA扩增一倍.PCR技术特点1,高度的敏感性.2,高度的特异性.3,操作简便快速.4,样品适用广泛.5,有一定程度的单核苷酸错误掺入.引物要扩增模板DNA,首先要设计两条寡核苷酸引物,所谓引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段,两引物间距离决定扩增片段的长度;两引物的5端决定扩增产物的两个5末端位置.由此可见,引物是决定PCR扩增片段长度,位置和结果的关键,引物设计也就更为重要.引物的设计引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序列必须是已知的,两引物之间的序列未必清楚,这两段已知序列一般为18～21个碱基,可以用DNA合成仪合成与其对应互补的二条引物. (1)引物长度:18-21bp (2)(G+C)%含量:引物的组成应均匀,尽量避免含有相同的碱基多聚体.两个引物中(G+C)%含量一般以40%～60%为佳.(3)引物的结构:无明显的次级结构(4)引物之间:不应发生互补(5)引物3端配对精确和严格1,dNTP: PCR常用的浓度为50～200μmol/L,不能低于10～15μmol/L.四种dNTP的浓度应相同.2, 缓冲液:10 mM Tris.HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2.3,模板DNA:纯度与含量.4,反应参数.PCR的影响因素1. 变性--考虑酶的失活问题.一般为反应开始时用95oC×2- 5 min,在后续循环中设为94oC× 30 s - 1 min;2. 退火--退火温度取决于引物的碱基组成,长度及引物与模板的匹配程度,一般在Tm – 20-25oC左右;时间一般为30 s - 2 min;3. 延伸—温度一般为72oC;时间取决于待扩增片段的长度.在通常情况下,Taq酶的延伸速率约为2 kb/min,而pfu为1 kb/min .4. 在最后一个循环结束后,需再在72oC下延伸10 min,以产物完整.单,双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品.若起始材料是RNA,须先通过逆转录得到第一条cDNA.为了保证反应的特异性,还应用ng级的克隆DNA,μg水平的单拷贝染色体DNA或102-105拷贝的待扩增片段作为起始材料.模板可以是粗品,但不能混有任何蛋白酶,核酸酶,Ta