tm值差异型不对称扩增方法的建立及其在分子诊断中应用.docVIP

Tm值差异型不对称扩增方法的建立及其在分子诊断中应用 饶华春1，滕继云1，刁 勇1，宋沁馨2, 3，王立强1，杨会勇1*，周国华2* （1. 华侨大学生物医学学院/分子药物研究院，教育部分子药物研究中心，福建 泉州，362021；2. 南京军区南京总医院药理科，江苏 南京，210002；3. 中国药科大学药物分析教研室，药物质量与安全预警教育部重点实验室，江苏 南京，210009） 摘要：多数分子诊断方法对靶基因的检测都是以单链DNA为基础的，如何获得大量和高质量的单链靶DNA分子一直是研究热点。以包含BACK1基因上三个SNPs的DNA片段为研究对象，调整不对称扩增引物碱基序列组成（5’端引入错配或加入锁核苷酸（locked nucleic acid, LNA）和使用浓度（相差10倍）来增加不对称引物间Tm值差异，改进扩增条件（采用添加增强剂的扩增缓冲液，不同退火温度的二阶循环扩增程序）后，进行不对称扩增来产生大量单链靶分子DNA产物。结果表明Tm差异的不对称扩增（Tm difference asymmetric amplification , TDA-PCR）可有效提高单链DNA分子产率，引物设计难度降低，模板序列的适用范围也扩大；本文还针对禽流感病毒H5N1的血凝素（Haemagglutinin, HA）基因保守序列进行不对称扩增，用获得的单链DNA为模板进行焦磷酸测序检测，得的结果与参考序列一致而且无明显干扰信号。因此，采用Tm值差异性的不对称扩增可使焦测序等分子诊断流程更为简便、成本更低、效率更高，具有很好的通用性和实用性。 关键词：改进的不对称扩增，单链模板制备，单核苷酸多态性，焦测序，禽流感病毒 中图分类号：Q 7 文献标志码：A 如何针对诸如糖尿病、心血管疾病、肿瘤等难治性疾病进行防治是当前医药工作领域面临的迫切而又困难的任务，这些疾病与传染病性疾病一起成为造成我国人口死亡的主要因素。目前针对这些难治性疾病的研究越来越多，新的机制和理论不断被提出，总的认识就是这些疾病均与人类基因相关，在一定可以程度上可以说这些疾病均属于分子疾病。因此阐明这类疾病的分子机制成为有针对性制定治疗方案的前提条件。 以人类疾病相关基因序列的检测与功能研究为主要任务之一分子诊断学可为这些疾病的分子机制研究提供方法和积累数据。其中焦磷酸测序是当前分子诊断较为常用的手段，被认为一种短片段DNA分析检测的理想平台。 焦磷酸测序是基于DNA合成延伸反应的测序技术[1-2]，不需要电泳和荧光标记，可实时分析测序引物相邻的碱基序列，目前已在分子诊断中如基因特异位点检测[3-4]和大规模测序[5-6]、疾病相关基因检测[7-8]、病原微生物快速检测与确定[9] 等领域得到广泛应用。因此本文选择焦磷酸测序技术来检测通过优化前后不对称扩增获得的单链DNA样本制备质量及其在分子诊断中应用效果。 单链DNA样品的获取是很多分子诊断技术的关键步骤之一[1]，如探针杂交[10]、实时荧光定量-PC R [11] 、适体筛选[12]、生物传感器[13-14]、疾病诊断与检测[15]、甚至用于基因表达调控[16]，单链DNA样品质量直接关系到以上述检测平台为基础的检测与研究结果的分析和效果评价。目前单链DNA样品制备主要采用微球捕获法[1,17]，此方法可获得单一的单链产物，但制备步骤繁琐，易发生交叉污染。一般不对称扩增被认为可以产生大量单链DNA样品，但是很多时候扩增效率并不稳定，指数线性PCR（Linear-After-The-Exponential (LATE)–PCR）技术对不对称PCR扩增技术进行了改进，将引物及扩增产物Tm计算引入到不对称PCR实验设计中[18-21] ，还发展为可高效率制备用于焦磷酸测序及其他分子诊断平台的单链寡核苷酸分子[22-24]，可以说LATE-PCR即一种Tm值差异型不对称扩增PCR。但是LATE-PCR要产生高效产生单链苷酸分子，需大量引物的Tm值、限制性引物Tm值和扩增产物的Tm值（melting temperature of the limiting primer(TmL), melting temperature of the excess primer(TMX) and melting temperature of double-stranded amplicon(TmA)）满足TmL-TmX≥3-5°C和TmA-TmX≤13-18°C 两个条件[23, 25]；经过分析和实验表明，对于很多富含AT的序列以及较长的目的片段，LATE-PCR的引物设计将变得十分困难。 本文通过分析不对称扩增体系中引物和扩增产物Tm值，进一步研究Tm在不对称扩增中与扩增效率和扩增特异性的关系，通过提高大量引物的Tm值（