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第七章 DNA重组技术 不同来源的DNA分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合的过程，称为DNA重组（DNA recombination） 。重组DNA技术（recombinant DNA technology）作为分子生物学的一项重要技术得到了迅速的发展。利用重组DNA技术对DNA分子进行剪切和重新连接，构成重组DNA分子，然后把它导入宿主细胞，进而扩增相关DNA片段，表达相关基因的产物，是进行基因功能研究的基本方法。克隆（clone）是指由一个细胞经过无性繁殖以后形成的子代群体。构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁殖体系，即DNA的分子克隆（molecular cloning）过程。因此，重组DNA技术又称为分子克隆技术或基因工程技术。 第一节 工具酶 一、限制性内切酶 限制性内切酶（restriction endonucleases，RE）是其中最重要的工具酶之一。它是一类核酸水解酶，能识别和切割双链DNA分子中的特定核苷酸序列。 命名原则 限制性内切酶大多从细菌中发现，根据来源进行命名，限制酶的第一个字母（大写，斜体）为宿主菌的属名，第二、第三个字母（小写，斜体）代表宿主菌的种名缩写，第四个字母（斜体）是株或型，最后的罗马数字表示同株内发现和分离的先后顺序。如从流感嗜血杆菌中分离到的几种限制性内切酶分别命名为HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ等等。 分类 根据酶的结构、作用的不同，可将限制性内切酶分为三种类型。Ⅱ型限制性内切酶具有高度特异性的DNA裂解点,而Ⅰ型和Ⅲ型兼有修饰（甲基化）作用和依赖于ATP的活性，但不能在识别序列上直接裂解DNA，故用途较少。因此，Ⅱ型限制性内切酶是基因工程和基因诊断中重要的工具酶，通常不特别说明的即为Ⅱ型限制性内切酶。 限制性内切酶的功能 限制性内切酶识别位点以双链DNA分子的4～8个特异性核苷酸顺序为多见，其中6个核苷酸顺序最常见。酶解后5′末端为磷酸基，3′末端为羟基。限制性内切酶的识别序列一般具双重对称性，切口共有三种类型：①5′末端突出型；②3′末端突出型；③平末端型。例如EcoRI识别序列为GAATTC，酶水解发生在GA之间，产生错开的5′突出末端；PstI的识别序列为CTGCAG，水解发生在AG之间，产生错开的3′突出末端；而HpaI识别序列为GTTAAC，水解发生在TA之间，产生不错开的平末端（blunt end）。错开突出的单链末端，很容易与互补的单链末端配对“粘合”起来，因此称为粘末端（cohesive end） 限制性内切酶切口类型 限制性内切酶 识别序列 酶切位点 末端类型 EcoRI 5′－GAATTC－3′ 5′－G AATTC－3′ 5′端粘末端 3′－CTTAAG－5′ 3′－CTTAA G－5′ PstI 5′－CTGCAG－3′ 5′－CTGCA G－3′ 3′端粘末端 3′－GACGTC－5′ 3′－G CGTC－5′ HpaI 5′－GTTAAC－3′ 5′－GTT AAC－3′ 平末端 3′－CAATTG－5′ 3′－CAA TTG－5′ 来源不同但能识别和切割同一位点的酶称为同工异源酶（isoschizomer）。如BamHI和BstⅠ(G↓GATCC),Xho和PaeR7(C↓TCGAG)，这些同工异源酶可以互相代用。 另有些限制性内切酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶（isocaudarner）。例如BamHI(G↓GATCC)和Sau3AI(N↓GATCN)，由此产生的DNA片段可通过粘末端相互连接，使DNA重组有更大的灵活性。 反应条件 限制性内切酶种类很多，来源不同，但反应条件都很相似。 表7-2 限制性内切酶的一般反应条件 条件 反应类型 分析用 制备用 反应体积 DNA 限制性内切酶用量 Tris-HCl(pH7.5) MgCl2 β-巯基乙醇 牛血清白蛋白 NaCl 保温时间 反应温度 20～100μl 0.5～1ml 0.1～10μg 10～30μg 1～5U/μgDNA 1～5U/μgDNA 20～50mmol 50mmol 5～10mmol 10mmol 5～10mmol 5～10mmol 50～500μg/ml 200～500μg/ml 5%