细胞分离与培养技术.pptVIP

* 再加入含0.25%胰蛋白酶的D-Hank’s液4ml，培养消化30min 将培养液移至离心管中，1200rpm离心10min，弃上清 200目尼龙网纱过滤，1200 rpm离心10min，弃上清 将获得的细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养24h，弃去未黏附细胞（如淋巴细胞，红细胞），此时的贴壁细胞即为原代滑膜细胞 4.组织块培养法 举例（成纤维样滑膜细胞组织块培养法）： * 无菌取滑膜组织，去除脂肪、纤维等，用不含钙镁的D-Hank’s液（含青霉素200kU·L-1、链霉素200mg·L-1）反复冲洗后剪成1~2mm3小块 用吸管吸取均匀排列于培养瓶（预先用含20％胎牛血清DMEM培养液湿润）的底壁，瓶底朝上，37℃、5%CO2培养箱中培养3h，使其贴壁 * 待细胞快长满时用0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代培养， 取第3~5代细胞用于实验 观察到有大量成纤维细胞长出后轻轻去除组织块，继续培养 轻轻翻转培养瓶，使培养液刚刚覆盖组织块，每隔2~3天换一次培养液 * 培养24h 培养96h 培养120h 举例（初步淋巴细胞分离法）： * 放血处死动物，无菌取胸腺和脾组织，去除脂肪和结缔组织，放入盛有含5%小牛血清的D-Hank’s液（不含钙镁，含青霉素200kU·L-1、链霉素200mg·L-1）平皿的网纱中（200目） 用注射器针芯轻轻碾碎胸腺和脾组织，使单个细胞经网进入溶液中 溶液移入离心管中， 1200 rpm离心10min，弃上清， D-Hank’s液洗涤细胞，加入DMEM培养液计数和调节细胞浓度，进行培养 举例（乳鼠原代心肌细胞培养法）： 基本原理： 心肌细胞培养方法有离体心脏灌注法、酶消化法和组织块法，将心肌组织分离成单个细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，在体外适宜条件下使之生长繁殖，并保留其结构与功能特性。 * 评价： 离体心脏灌注法对乳大鼠来说实施难度大; 酶消化法操作流程长，细胞对消化酶浓度及作用时间要求严格，但是能得到大量单细胞； 组织块法操作简单，实验成本低，可得到具较高纯度的心肌细胞。 因此，心肌细胞原代培养常用的方法多用酶消化法和组织块法两种。 * 心肌细胞的酶消化培养法： 1.心肌组织的选择： 生后1~4天的Wistar乳鼠心脏等。 2.心肌组织块的制备： 乳鼠用75%乙醇/1%新洁尔灭消毒皮肤，无菌开胸，暴露心脏，于心脏收缩期剪下心脏，置于盛D-Hank’s 液的培养皿中，剪开心脏，清洗三次，以去除血污。 * 3.心肌细胞悬液的制备： 取心尖部组织（心室）剪为1mm3碎块，在大离心管中放入组织碎块，加入0.06%~ 0.25%的胰蛋白酶溶液8~15ml，在磁力搅拌器上，37℃水浴消化10min，自然沉淀后弃上清。剩余组织块中再加入新胰蛋白酶， 消化10min，静置后将上清液移入盛有15%新生牛血清培养液的离心管中终止消化，并以1000rpm离心10min，弃上清，用培养液充分吹打成单细胞悬液。剩余沉淀用同样条件及方法反复消化，直至将组织基本完全消化为止，分次收获心肌细胞。 * 4.心肌细胞悬液的接种： 将分次收获的心肌细胞用Hank’s 液离心清洗1~2 次，弃上清液。将沉淀细胞定量加入培养基3~5 mL，吹打混匀，制成细胞悬液。应用白细胞计数板计数细胞，调整至所需浓度，37 ℃、5 % CO2 培养箱培养。 5.细胞纯化： 培养2 h，将细胞悬液进行换瓶培养，去除瓶底的贴壁细胞；2 h 后，去除瓶底的贴壁细胞，重复一次，方法同前，以去除成纤维细胞，纯化心肌细胞。 * 心肌细胞的贴块培养法： 1.取材：按前述方法取出心脏，置于盛Hank’s 液的培养皿中，清洗三次。 2.贴块：将心脏剪为1mm3大小的小块，移入培养瓶底面，用无菌牙科探针将其均匀铺开。 3.干固：盖上瓶盖，37 ℃烤箱培养瓶翻转干固1~1.5 h。 4.接种培养：添加少量培养基，以恰好盖住组织块为佳，次日加足培养液。 * * 三、从原培养容器中分离细胞（传代培养） 贴壁细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传代扩增。 * 对于贴壁不太紧的细胞如人胚胎肾（HEK）293细胞等，可以直接吹散后分瓶; 对于贴壁较紧的细胞如中华仓鼠卵巢（CHO）细胞、滑膜细胞（Synoviocytes）等，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶（以下操作均按无菌操作的要求进行）： * * 将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去 加入0.25％胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.