高效液相色谱法（hplc）测定血清维生素a.pptVIP

高效液相色谱法(HPLC)测定血清维生素A 营养学系：王冬亮 色谱法的发展 色谱法是一种现代的分离方法 1906年正式命名 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代 色谱法原理 色谱法的原理 是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等各种作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离。 两相中有一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase),有一相是流动的,称为流动相(Mobile Phase),流动相又叫洗脱剂,溶剂 相(Phase): 物理化学术语,特指在某一系统中,具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面 色谱法分离原理 色谱法分类 按流动相的物态分: 气相色谱 (Gas Chromatography, GC) 用气体作为流动相(又叫载气) 液相色谱 (Liquid Chromatography, LC) 用液体作为流动相(又叫洗脱剂) 按固定相的形态分: 平面色谱 纸色谱 薄层色谱 柱色谱 高效液相色谱的产生 经典液相色谱 大直径的玻璃管柱，室温和常压下用液位差输送流动相，柱效低、时间长(常有几个小时)。 高效液相色谱（High performance Liquid Chromatography，HPLC） 填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,高阻力,高压，分析速度快。 HPLC流程及主要部件 2.主要部件 (2) 进样装置 (3) 色谱柱 (4) 液相色谱检测器 HPLC应用 应用领域 医药、食品、环保、生命科学、农业、化工等等 可分析化合物：80%以上的有机物如药品、氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等 血清维生素A的测定 1.样品前处理 300 ml 血清+ 300 ml甲醇，震匀1-2min，离心1500 转（15 min），转移上清至新的EP管 2. HPLC法检测 色谱柱：C18,5mm，250×4.6 mm 进样量：50 ml 流动相：甲醇：水=98:2 流速：1.0 ml/min 检测：325 nm 内标：苯并芘 （暂无） 谢谢！ * * 将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带 Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法) 固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 进样 (Injection) 洗脱 (Elution) 相互作用(Interaction) 是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离。 高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分 析速度极快，只需数分钟。 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。 高灵敏度：检测器灵敏度高：UV——10-9g, 荧光检测器——10-11g。 高效液相色谱特点 1.流程 HPLC仪器结构示意图（方框图） 高压输液泵 主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 应具有压力平稳、脉冲小 流量稳定可调、耐腐蚀等特性 梯度洗脱 耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示： 柱体为直型不锈钢管，标准内径4.6, 3.9, 2, 2.1, 3 mm，柱长3～30 cm，填料颗粒粒度3-10μm,柱效7000-10000。发展趋势是减小填料粒度(3－5μm)和柱径以提高柱效。 A. 可变波长紫外检测器(ultraviolet photometric detector) 原理：朗伯比尔定律（当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度? ?与吸光物质的浓度? ?及吸收层厚度?成正比 ） 优点：应用最广，对大部分有机化合物有响应，灵敏度高，线性范围宽。是高效液相色谱仪的标准配置。 缺点：对无紫外吸收的组分不响应。 凡是混合物中某有机物的分析均可想到HPLC法 *