葡萄糖氧化酶.docVIP

葡萄糖氧化酶 一、酶的简介 葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，简称GOD)能够在有氧气的条件下专一性催化β-D- 葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢,高纯度GOD的制剂为淡黄色粉末、易溶于水，完全不溶于乙醚、氯仿、甘油和乙二醇[1]。50%丙酮、66%甲醇能使其沉淀。它广泛地分布于动物、植物和微生物体内，但由于微生物具有生长繁殖速度快，来源广等特点使之成为葡萄糖氧化酶的主要来源，微生物中的主要生产菌株为黑曲霉和青霉。葡萄糖氧化酶是用黑曲霉等发酵制得的一种需氧脱氢酶，对人体无毒、副作用，具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等功能，它广泛应用于食品、饲料、医药等行业中，具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用。【2】 二、菌种及培养基 2.1 菌种：以黑曲霉H1-9b为菌种，在发酵罐中装入培养基 2.2 发酵培养基(g/L)：蔗糖80、蛋白胨 3、KH2PO4 2、MgSO4·7H2O 0.7、KCl 0.5、NaNO3 4，pH5.5； 斜面培养基(g/L)：蔗糖30、NaNO32、K2HPO41、KCl 0.5、MgSO4 0.5、FeSO40.01、琼脂20，pH5.5【3】。 发酵条件为：26～29摄氏度，pH值自然，通风量0．3m3／(m3·min)，搅拌速度400r／min。发酵液离心分离得菌丝体，经研磨(因葡萄糖氧化酶是一种胞内酶，提取时首先必须先研磨破壁)后过滤，得到含葡萄糖氧化酶的滤液即酶液。[4] 工艺流程 葡萄糖氧化酶制备流程图 葡萄糖氧化酶下游工艺流程图 3.1葡萄糖氧化酶的发酵 3.1.1种子液培养在斜面培养基上接种黑曲霉H1-9b 孢子，28℃培养4 ～5 d 。 3.1.2摇瓶发酵250mL 锥形瓶中分装 50mL 发酵培养基，121℃灭菌20min，接种黑曲霉 H1-9a 孢子浓度为 104个 /mL，28℃、200r/min 摇床培养 80h 即达产酶高峰。 3.1.3菌丝体的制备摇瓶发酵培养完成后，用纱布过滤发酵液，收集球状菌丝体，用双蒸水将其反复冲洗，直至把发酵液冲干净；再用 0.2mol/L pH5.7的磷酸缓冲液冲洗菌丝体，压干水分，称质量后收集备用[5]。 3.2 粗酶液的制备 本实验采用研磨法破碎菌丝体。将菌丝体置于研钵中，加入适量石英砂，对菌体进行研磨；充分研磨后按1:1(m/V)加入预冷的0.2mol/L pH5.7磷酸缓冲液浸提粗酶，4℃抽提 2h。抽提完成后 4℃、12000r/min 离心20min，取上清液，即为粗酶液，透析 1d 后收集备用。 3.3 DEAE-Sepharose 离子交换层析 用300mL 0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl缓冲溶液平衡DEAE-Sepharose 离子交换层析柱，取 5mL 粗酶液上样，用0～1mol/L NaCl(用0.05mol/L，pH7.1 的 Tris-HCl缓冲溶液配制)进行梯度洗脱，流速 0.5mL/min，每管收集5mL，层析完成后收集 GOD 活性管，透析脱盐，冷冻干燥后备用[6]。 3.4 Superdex-200 凝胶过滤层析 用 0.05mol/L pH7.1 的 Tris-HCl 缓冲溶液平衡Superdex-200 凝胶过滤层析柱过夜，将冷冻干燥后的样品加水稀释至2mL上样，用0.05mol/L pH7.1 的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，流速 0.3mL/min，每管收集 3mL，层析完成后收集 GOD 活性管，透析脱盐，冷冻干燥得到 GOD 纯品[7]。 分离纯化步骤说明：分离和纯化葡萄糖氧化酶的方法很多，包括沉淀法、吸附法、离子交换法、凝胶过滤和亲和色谱等方法，这里先介绍沉淀法和离子交换法。 沉淀法：选择合适的沉淀剂浓度，通过分级沉淀或一步沉淀，可将葡萄糖氧化酶与其他蛋白质初步分开，此法单独使用时提纯效果较差，一般比活性只能提高一倍左右，使用价格便宜且操作简单的沉淀法和吸附法，葡萄糖氧化酶的比活性提高不大； 离子交换法：提纯的葡萄糖氧化酶的比活性(一般为200—250U／mg)较沉淀法和吸附法为高，产率30％一60％。离子交换法是较为理想的方法，如Amberlite CG一50树脂对葡萄糖氧化酶具有良好的吸附性，适合于工业规模制备葡萄糖氧化酶[8]。 从整个分离纯化过程看，纯化效果较好，纯化倍数较高。 四、产品检测 1、酶活性测定 邻联茴香胺法[9] 【试剂】 酶：葡萄糖氧化酶浓度为1-4mg/ml 缓冲液：PH6.0 0.1M PB 底物：18％葡萄糖 产物H2O2用偶联的HRP酶反应测定：HRP水溶敝，含60U／m1；1％邻联茴香胺水溶