核酸等温扩增技术的定义及特点.pptVIP

核酸等温扩增技术是一类分子生物学技术的总称，它们能在某一特定的温度下扩增特定的DNA或者RNA。 与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足快速简便的需求。 核酸等温扩增技术的定义及特点 环介导等温扩增技术（LAMP） 依赖于核酸序列的扩增技术（NASBA） 滚环扩增技术（RCA） 单引物等温扩增技术（SPIA） 依赖于解旋酶的等温扩增技术（HAD） 链替代扩增技术（SDA） 快速等温检测放大技术（RIDA） 切刻内切酶核酸恒温扩增技术（NEMA） 核酸等温扩增技术的分类 环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是2000年日本研究人员Notomi等发明的一种新型体外等温扩增特异性核酸片段的技术。 该技术主要利用两对特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，从而保证引物可以在等温条件下顺利与模板结合，并进行链置换扩增反应。 环介导等温扩增技术（LAMP） LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。 15-60min内可扩增出109-1010倍靶序列拷贝，得到500ug/ml的目的DNA。具有简单、快速、特异性强的特点。 LAMP的特点 LAMP技术的原理 LAMP主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，在等温条件进行扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成，所有靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有、无来判别。有、无扩增反应是利用荧光定量PCR仪检测反应的荧光强度或利用核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀反应用浊度仪检测沉淀浊度来判定。 主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。 B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。 LAMP引物设计