【2017年整理】酶工程实验(new).doc

PAGE PAGE 33 酶工程实验 西北民族大学生命科学与工程学院 柏家林 刘俊林 仅供2008级生物工程专业和生物技术专业本科生试用前 言 生物工程已成为发展最快、应用最广、潜力最大、竞争最为激烈的科技领域之一，也是最有希望取得关键性突破的学科之一。生物工程产业作为一个正在崛起的主导性产业，已成为产业结构调整的战略重点和新的经济增长点，将成为我国赶超世界发达国家生产力水平、实现后发优势和跨越式发展最有前途、最有希望的领域。 酶工程是生物工程的四大重要组成部分之一，是酶学和工程学相互渗透、相互结合发展而形成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程等有机结合而产生的边缘学科。酶作为生物催化剂具有催化专一性好、效率高、作用条件温和等优点，已广泛应用于医药、食品、轻工、化工、能源、环保、检测、生物技术等领域，深刻影响着许多重要的科学和实践领域。 《酶工程实验》与教材内容紧密结合,旨在通过实验强化学生对课堂内容的理解和掌握。结合我院实验条件，《酶工程实验》选择了十三个实验，主要集中在酶及酶工程概论、微生物发酵产酶、酶的提取和分离纯化、酶活力测定、酶的固定化和酶的分子修饰等章节，基本上反映了教材内容。 《酶工程实验》可作为生物技术、生物工程、食品生物技术、生物制药等专业学生的参考用书，也可供相关行业的技术人员参考。 编者 柏家林 刘俊林 二00九年十二月 目 录 实验一 酶促反应中初速度时间范围测定 实验二 pH对酶活力的影响—最适pH的测定 实验三 温度对酶活力的影响—最适温度的测定 实验四 米氏常数和最大反应速度的测定 实验五 抑制条件下米氏常数和最大反应速度的测定及抑制类型的判定 实验六 碱性蛋白酶的吸附固态发酵生产 实验七 溶菌酶的提纯结晶 实验八 α-淀粉酶活力测定 实验九 酸性磷酸酯酶的提取和酶活力测定 实验十 溶菌酶的制备及活力测定 实验十一 果胶酶的固定化 实验十二 固定化酶活力测定 实验十三 胆绿素还原酶的修饰与活性基团的鉴定 实验一 酶促反应中初速度时间范围测定 一、实验目的 1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理； 2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。 二、实验原理 酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, EC 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。 酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate, NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。 利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。 酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。 要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。 三、实验试剂与器材 1.试剂 （1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取） （2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到） 取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A405在0.6～0.7之间。 （3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯 精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。 （4）0.3mol/LNaOH溶液 2．器材 恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。 四、操作步骤 1.酸性磷酸酯酶原酶液的制备 称取一定重量的绿豆，浸泡24h，在25～30°C温箱中培养5～7d。长出的豆芽取其颈部，依次用自来水和重蒸水冲洗干净，置滤纸上吸干水分，称30g 放入研钵中匀浆，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置4°C冰箱中6h以上。然后用双层纱布挤压过滤，滤液6000r/min离心15min,上清液置透析袋用蒸馏水充分透析，间