再生丝素膜的生物安全性评估试验.docVIP

再生丝素膜的生物安全性评估试验 周婵，王介平，吕金凤，王海燕，曾秀* 重庆市畜牧科学院，重庆 402460 摘要：以再生丝素蛋白为原料，采用旋转干燥法，通过控制温度和湿度及乙醇改性，最终得到不溶于水的丝素膜。为了评价再生丝素膜的生物安全性，进行体外细胞毒性、全身过敏反应、迟发型超敏反应、急性毒性反应、热原反应以及溶血性试验。结果：用丝素膜浸提液对体外培养的成纤维细胞进行处理后，细胞平均相对增殖率为92.3%，属于细胞毒性I级。小鼠经由100%丝素膜浸提液多次致敏后再次激发，未产生全身性过敏反应；供试小鼠静脉大剂量注射100%丝素膜浸提液后全部存活，无急性全身毒性反应，7d观察期内小鼠的体质量逐步增长；用100%丝素膜浸提液对家兔进行静脉注射后，兔的单只体温升高幅度为0.2～0.5 ℃，未超0.6 ℃上限，总和也未超1.4 ℃上限；选取不同剂量（100%、50%、25%、10%）丝素膜浸提液对家兔进行溶血试验，溶血率为4.02%、2.57%、1.56%、1.01%，均小于5%。综上所述，本研究制备的再生丝素膜状材料，具有良好的生物安全性。 关键词 再生丝素；蛋白；膜状材料；生物安全性； 由于各种外界烧伤、烫伤或是手术造成的皮肤缺损是修复重建外科的常见疾病。人工皮肤的研究随着生物材料的发展成为医用生物材料领域的研究热点[1-3]。目前，应用于人工皮肤研制的生物材料主要有：胶原、聚乳酸（PLA）、聚己内脂（PCL）等[4,5]。单一的材料受到本身性质如力学性质、亲疏水性、内部结构等的限制，难以达到人工皮肤所要求的条件，因此，利用多种材料复合，通过其组成成分之间互相取长补短，更加契合人工皮肤制作材料的要求和标准[6,7]。要复合多种材料，就要利用化学或物理的方法将材料进行有目的性的改性，改变分子结构、功能化学键等。同时要有与天然高分子相似的结构，保持最大程度的生物相容性[8]。 由丝素和丝胶蛋白聚合而成的蚕丝，是一种具有特殊力学性质、能降解、透气，并有良好生物相容性的天然蛋白质[9,10]。丝素蛋白从来源上分为天然丝素和再生丝素。直接从家蚕的后部丝腺得到的是天然的丝素，不含丝胶蛋白，呈白色半透明状[11-13]。利用化学的方法将丝胶和丝素分离，并去除其他物质后得到就是再生丝素。现行制备丝素蛋白的方法以及利用丝素蛋白制备生物膜材料的方法，都是在破坏蚕丝原有结构的基础上完成的[14-15]。原有结构被破坏，伴随的是结晶区的空间构造随之发生变化[8-10]。最大限度的利用蚕丝的天然结构制备膜材料，不但能充分发挥蚕丝的优势，还能最大限度的保留蚕丝的生物相容性。 本课题组以再生丝素蛋白为原料，采用旋转干燥法，通过控制干燥的温度和湿度，将丝素蛋白溶液的浓度浓缩至18%，干燥温度控制在60℃，用乙醇进行改性，最终得到表面光滑，断面为凹凸的网状结构的不溶于水的丝素膜。本试验针对再生丝素膜利用实验动物进行生物安全性评估试验，为再生丝素膜材料的利用提供重要试验依据。 1 材料与方法 1.1 再生丝素膜的制备 1.1.1 丝素蛋白溶液的制备[13-17] 将去蛹的家蚕茧，在5g/L Na2CO3 溶液中脱胶2次，每次30min，温度98 ℃，浴比1:50，98 ℃，浴比1:10，37 ℃±1 ℃温度下浸提24 h， 8000 r/min离心5 min，取上清液过滤除菌（0.22 μm），4 ℃保存备用。 1.2 生物安全性测[22] 将成纤维细胞培养至对数生长期，胰酶消化吹打均匀成细胞悬液，接种于96孔板，每孔加入200微升，使孔底细胞密度为5000-10000个/孔。分为：阴性对照、阳性对照和再生丝素膜组，每组各设置12孔。置于5% CO2培养箱37 ℃培养24 h后，弃孔内原培养液。加入受试物：DMEM培养基（含10%胎牛血清）、5 g/L 苯酚溶液、再生丝素膜浸提液（100％、50%、25%、10%），每孔200 μL。继续培养，分别于24、48、72h后加入20μL、5 g/L 的MTT 溶液，4h后重新加入200μLDMSO溶液，震荡10min，测量细胞悬液OD（490nm）。按以下公式计算细胞相对增殖率: RGR=a/b×100%, 式中，RGR—相对增值率（%），a—再生丝素膜组（阳性对照组）吸光度，b—阴性对照组吸光度。 1.2.2 全身过敏反应试验 选取体重为（25±2）g的健康昆明小鼠（许可证号：scxk(渝24只，雌雄各半，随机分成4组：浸提液高剂量组（100%）、浸提液低剂量组（10%）、阳性对照（10%蛋清溶液）、阴性对照（9 g/L NaCl注射液）。连续3次隔日腹腔注射0.5 mL致敏，首次注射后14 d和21 d自耳静脉注射1mL激发，观察小鼠有无躁动、搔鼻、颤抖、喷嚏、竖