07实验七等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点.pptVIP

实验七 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点 一、目的要求 1.学习和掌握圆盘电泳技术 2.学习和掌握等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点原理和方法 二、原理 蛋白质属于两性电解质，所带电荷的性质与数量与所处环境的pH值有关： 环境pHpI，带正电，电场下向阴极移动； 环境pHpI，带负电，电场下向阳极移动； 环境pH=pI，不带电，电场下不移动。 有一类两性电解质：它具有依次递变而又相差不大的等电点，在电场下形成递变而又连续的pH梯度，故在电泳介质中加入这种物质则能造成介质pH由酸到碱逐步变化。 两性电解质载体(carrier ampholytes) (1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。 (2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。 (3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。 (4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。 图 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面) 四、操作方法 1. 凝胶柱的制备 （1）玻璃管的一端插在橡皮帽中 （2）配胶 表 10mL 7.5%凝胶的配制 试 剂 名 称 体积(mL) 凝胶贮液 2.5 两性电解质载体 0.5 蒸馏水 6.75 10%过硫酸铵 0.05 10%TEMED 0.1 蛋白质混合样品 0.1 混匀后置真空干燥器中抽气 10 min （3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。 （4）待凝胶聚合 2. 电泳 将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L氢氧化钠溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸缓冲液。连接到电泳仪，接通电源，调电压至160 V，聚焦过夜，至电流降为0，则可关闭电源。 3．剥胶 电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在凝胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出。 4 .固定染色 取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定20min?2后，倒掉固定液后用脱色液漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端的距离。 IEF测定蛋白质pI 6. pH梯度的制作 取已知等电点的标准蛋白聚焦凝胶条放在玻板上，量出各蛋白条带至正极端的实际长度，以条带实际长度为横坐标，对应的pH值为纵坐标，绘制标准pH梯度曲线。 五、思考题 (1)简述聚丙烯酰胺等电聚焦电泳的基本原理。 (2)进行聚丙烯酰胺等电聚焦电泳时的注意事项有哪些？ * * 等电聚焦原理： 利用：1)各种蛋白质pI不同 2）两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的连续而稳定的pH梯度 以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持介质，并在凝胶中加入两性电解质载体，在电场作用下，蛋白质在此pH梯度的凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。 三、实验试剂与仪器 1）两性电解质 2）30％丙烯酰胺溶液 3）TEMED 4）10％过硫酸铵溶液 5）负极缓冲液：0.1M NaOH 正极缓冲液：0.1M 磷酸或硫酸 固定液：10％（W/V）三氯乙酸 染色液 脱色液 蛋白质等电点标准 电泳仪 圆盘电泳槽 5 .蛋白质条带聚焦位置的计算 求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为： 蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离? 固定染色前凝胶条长度 固定染色后凝胶条长度 计算出待测蛋白质聚焦部位的实际长度后，直接从pH梯度曲线上求出该蛋白质等电点。