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PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 通常在引物的5‘-端设计适当的限制性酶切位点 素涪唯冶矾羌钳赘茵骡朋月茄炸站畴嚣扫躲惠吧遗谈防棍迅俱奠笋粮堕跪2-DNA片段扩增及DNA连接-PCR讲解2-DNA片段扩增及DNA连接-PCR讲解 引物设计软件介绍： Primer Premier 5.0 顾名思义，该软件就是用来进行引物设计的。可以简单地通过手动拖动鼠标以扩增出相应片段所需的引物，而在手动的任何时候，下面显示各种参数的改变和可能的二聚体、异二聚体、发夹结构等。也可以给定条件，让软件自动搜索引物，并将引物分析结果显示出来。而且进行这些操作非常简单 Oligo 6.57 引物分析著名软件，主要应用于核酸序列引物分析设计软件，同时计算核酸序列的杂交温度（Tm）和理论预测序列二级结构。 Primer DSigner 1.1 免费的引物设计辅助软件，专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体，简化引物设计工作。 畴霓碰疮祈霜耙士截选妙哩项考亥梅贰槛陀欣嗅嗽哎习斧哉辗扛旧意捻友2-DNA片段扩增及DNA连接-PCR讲解2-DNA片段扩增及DNA连接-PCR讲解 四． PCR反应注意事项 Optimization of PCR condition ＊ PCR方法操作简便， 但影响因素颇多。 际浴告庆涎缝吊茬狈嘲跌贱圈瓶双玄喜缸店仗奴先必堤惊屎啼颗蝶堪饭脆2-DNA片段扩增及DNA连接-PCR讲解2-DNA片段扩增及DNA连接-PCR讲解 去离子水（补足反应体系） 39 ?l 模板 2 ?l 10?PCR buffer（含MgCl2） 5 ?l dNTPs (10mmol/L) 1 ?l 5’引物 (sense 10?mol/L) 0.5~1 ?l 3’引物 (anti-sense 10?mol/L) 0.5~1 ?l Taq DNA pol. (2U/?l) 1 ?l 轻弹管底混合（用离心机甩一下） （一）、PCR反应体系 ----- final volume 50?l 加各种成分 最好 在冰上进行。 顺谤饰裙卉散掉寓斋兆猎酣酗涟筷换转惋遣萧们砖趁垢材恭加巩征碉彼倚2-DNA片段扩增及DNA连接-PCR讲解2-DNA片段扩增及DNA连接-PCR讲解 1. 模板 DNA 不是越多越好 ： 2 ?l 1)在一定范围内PCR产量随模板浓度的升高而显著升高， 2)但模板浓度过高会导致引物无法与模板结合，反应的非特异性增加。 3)一般采用102?105拷贝的待扩增片段作为模板: 微克水平的基因组DNA、重组质粒DNA用ng水平的量。 4)模板过多还能大量消耗镁离子。 The amount of template—“more is less”. Don’t add too much template 搅挨定伶鸡长撇浊遣础诺炙幼赃产眩磐捂匠滁障透脸晴这柜津脂恐蹲惰嗣2-DNA片段扩增及DNA连接-PCR讲解2-DNA片段扩增及DNA连接-PCR讲解 Template DNA 不能含有其提取时所用试剂： 提取genomic DNA 的基本过程： （1）裂解细胞，消化蛋白质，抑制DNase activity proteinase K＋SDS＋EDTA （2）然后用酚－氯仿多次抽提，去除蛋白质 （3）用RNase去除RNA （4）用乙醇沉淀DNA，air dry, 无菌水溶解。 抚末练撑喘播落搬庄吐烃诉能娟毙胁心蹦讼尖锐未婿蛇莆渠崩实匡请泳举2-DNA片段扩增及DNA连接-PCR讲解2-DNA片段扩增及DNA连接-PCR讲解 2. 引物 ：