探针标记物制备.docVIP

探针标记物 ? ??? 利用分子杂交的原理对待测核酸进行检测，必须将与待测核酸进行杂交反应的探针用某种可以检测的分子进行标记。探针的标记是指将一些可以用一定的方法显示或检测的物质，即标记物结合在探针上的过程。??? 理想的探针标记物应具备以下特性： ??? ①高度灵敏性； ??? ②与探针的结合不影响探针的主要理化特性、杂交特异性和杂交稳定性； ??? ③显示或检测要简便、节时、准确可靠、重复性好； ??? ④对环境无污染，对人体无损伤。??? 目前用于标记原位杂交探针的标记物有20多种，可分为放射性标记物(放射性核素)和非放射性标记物两大类。??? 1．放射性标记物? 原位杂交技术最初建立时就是以放射性核素作为标记物。目前，放射性核素仍用于探针的标记。常用的放射性核素有32P、3H、35S等。用放射性核素标记探针有以下优点：放射性核素标记的核苷酸易掺入DNA和RNA分子中；标记反应的情况可通过特殊的仪器(闪烁计数器)进行监测；用放射性核素标记的探针进行的原位杂交反应，可用敏感性高的放射自显影技术检测。但放射性核素存在辐射危害。有半衰期限制，且放射自显影检测时间长。由于这些缺点，放射性核素标记探针的应用受到了限制。??? 2．非放射性标记物? 目前，非放射性标记物主要有以下几类： ?①酶类，如辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AKP)等；半抗原，如地高辛(DIG)及生物素等； ??? ②荧光素，如异硫氰酸荧光素(FITC)等。 非放射性标记物标记的探针虽然在敏感性方面不如放射性核素标记探针，但其稳定性和分辨率高，检测所需的时间短，一般在24小时即可得到结果，且操作简便，不存在放射性污染的安全问题。不需特殊的防护设备，因此非放射性标记物的应用日趋广泛。缺口平移法探针标记??探针的标记方法很多，大致可以分为两大类：引入法和化学修饰法。引入法是运用标记好的核苷酸来合成探针，即先将标记物与核苷酸结合，然后通过DNA聚合酶、RNA聚合酶及末端转移酶等将标记的核苷酸整合入DNA或RNA探针序列中去。化学修饰法即采用化学方法将标记物掺入已合成的探针分子中去，或改变探针原有的结构，使之产生特定的化学基团。引人法较化学修饰法更常用．按其整合的方法不同引入法可分为缺口平移法、随机引物法、末端标记法和PCR扩增标记法和RNA体外转录法等。 ? ??? 缺口平移法(nick translation)是一种最常用的标记双链DNA探针的方法，该方法利用DNA聚合酶I的多种酶促活性将标记的三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)掺入到新合成的DNA链中，从而合成高比活性的均匀标记的DNA探针。其基本原理是首先用适当浓度的DNA酶I在DNA探针分子的一条链上打开缺口(nick)，缺口处形成3’羟基末端；利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 5，→3，方向外切酶活性，将缺口处5，端核苷酸依次切除；与此同时，在大肠杆菌DNA聚合酶I的5，→3，聚合酶活性的催化下，以另一条DNA链为模板，以dNTP为原料，顺序将dNTP连接到切口的3，羟基上，从5，端向3，端方向重新合成一条互补链。其结果是在缺口的5，端，核苷酸不断被水解，而在缺口的3，端核苷酸依次被添加上去，从而使缺口沿着互补DNA链移动，原料中含有的标记核苷酸因此替代原DNA分子上的部分核苷酸而掺人到新合成的DNA链中，从而获得标记的DNA探针。此方法的缺点是需要较多的DNA模板(＞200ng)，且标记效率较低。 探针缺口平移法标记原理图 随机引物法探针标记??? 随机引物法的原理是使被称为随机引物(random primer)的长6个核苷酸的寡核苷酸片段与单链DNA或变性的双链DNA随机互补结合(退火)，以提供3，羟基端，在无5，→3，外切酶活性的DNA聚合酶大片段(如Klenow片段)作用下，在引物的3，羟基末端逐个加上核苷酸直至下一个引物。当反应液中含有标记的核苷酸时，即形成标记的DNA探针。6个核苷酸混合物出现所有可能结合序列，引物与模板的结合以一种随机的方式发生，标记均匀跨越DNA全长。当以RNA为模板时，必须采用反转录酶，得到的产物是标记的单链cDNA探针。随机引物法标记的探针比活性高，但标记探针的产量比缺口平移法低。 DNA探针的随机引物法标记原理图 末端标记法探针标记? ??? 末端标记法(end-labelling)是将标记物导入线型DNA或RNA的3，末端或5，末端的一类标记法，可分为3，末端标记法、5，末端标记法和T4聚合酶替代法。末端标记法主要用于寡核苷酸探针或短的DNA或RNA探针的标记，用该法标记的探针携带的标记分子较少。 ??? (1)5，末端标记法：5，末端标记法需要T4多聚核苷酸激酶(polynucleotide kilnase)，最常用的标记物是[γ32P]ATP。T4多聚核苷