REACH法规 第四卷译稿-21.docVIP

B.19. 体外姊妹染色单体的交换测定 1.方法 1.1 引言 见一般引言B部分 1.2 定义 见一般引言B部分 1.3.参考文献 无 1.4.测定法原理 姐妹染色体交换（SCE）测定法是一种短时测定法。它用于测定在一对被复制的姐妹染色体中的倒易DNA。SCE代表在表观匀称地区DNA复制产品的互换。虽然对于分子主要成分一无所知，交换过程可能包含了DNA的裂解和重组。SCE测定需要示差标记姐妹染色体，这可通过两个细胞周期间将溴化脱氧尿苷（BrdU）并入染色体DNA而做到。 如果适当，有无哺乳动物外源代谢活化体系，母体外哺乳动物细胞都接触于测定化学试剂下。且在含BrdU介质中培养两圈复制品。在处理纺锤体抑制剂（如秋水仙素）使细胞在有丝分裂（c-中期）中期富集，细胞被收集且染色体准备工作完成。 1.5.质量标准 无 1.6.测定方法描述 1.6.1 准备 初级培养基（人类淋巴细胞）或已固定的细胞线（如中国大鼠卵巢细胞）可被用于测定。还应检验细胞线有无细菌淋巴污染。 应使用合适的培养基方式和培养条件（如温度、培养容器、CO2浓度和湿度）。 在优先处理细胞后，测定物质应在培养基中准备，或溶解或悬浮在合适的显色剂中。培养基体系中最后显色剂浓度不能受到显著影响，细胞活体或生长速率和SCE影响频率应通过溶剂控制来监测。 有无外源性哺乳动物新陈代谢活化体系，细胞应接触于测定剂中。选择性的，在细胞本身新陈代谢活动类型使用的地方，活动速率和天性应适合于被测定的化学等级。 1.6.2 测定条件 培养基数目 至少双份培养基应被应用于每个实验点。 正负控制阳性和阴性对照使用 用直接作用化合物和新陈代谢活化化合物的正控制阳性对照，应该包含在每个实验；显色剂控制介质对照也应该也应被使用。 下面是用作正控制阳性对照的物质的例子： –直接作用化合物 –乙基甲烷磺酸盐 –间接作用化合物 –环磷酸分体酰胺 当适宜条件时，附加同样化学等级作为下级测定的正控制也可被包括。 接触浓度 至少使用三种适量空白浓缩浓度测定试剂。最高浓度会导致显著有害影响，但是依然可以发生足够的细胞复制。相对的，不溶于水的物质应用合适的步骤测出溶解度极限。对于全溶于水的无害物质，以上测定物质浓度应根据只要成分的不同情况来决定。 1.6.3.步骤 培养基准备 固定的细胞线株从贮备的培养基中繁殖（如胰蛋白酶或用甩脱），在培养基中用合适的密度种植，控温37℃培育。对于单分子培养基，每一个培养基容器中的细胞数应调整到使培养既不多与收获时合流的50%。选择地，细胞应被用于悬浮培养基。人类淋巴培养基使用合适的技术从用肝素处理过的血浆中提取，并在37℃ 处理 呈指数增长的细胞应在测定物质中接触合适的时间，大多数情况下，一至两个小时是有效的，但在某些情况下处理，时间应延长至两个完全周期。没有足够的 instrinsic 新陈代谢活性的细胞应在有和没有合适的新陈代谢体系的情况下分别接触在测定物质中。接触时期结束，应洗净细胞上的载体培养基和测定物质以利于BrdU副本的出现。本实验可选择的步骤为：将细胞同时接触在BrdU和测定化合物中达两个细胞周期，人类淋巴细胞载体在半同时情况下处理。 细胞在反映第二阶段被测定，以保证细胞周期中细胞在最急性阶段与化合物接触。所有加了BrdU的载体需要在黑暗中或白炽灯的微光下处理。其目的是保证收获细胞中BrdU包含DNA光分解减至最小。 细胞收获 收获前1-4小时细胞用纺锤体抑制剂（秋水仙素）处理，为准备染色体，单个细胞都应单独处理和收获。 染色体的准备和着色 染色体由标准细胞遗传技术准备，显示SCE时载玻片的着色可用几种方法来处理，例如荧光加上吉姆萨氏技术。 分析 细胞数目的分析应基于SCE的自然频率参考物质。通常分析SCE时，至少分析25个单位的良好展开的处于细胞分裂中期的细胞，载玻片在分析前应被编号。分析人类淋巴细胞时，指分析包括46个着丝点处于细胞分裂中期的细胞。建立细胞键时，只研究包含模式数码中的±两个着丝点的分类中期。因该说明标签的着丝点转换是否被计为一个SCE，并用独立的实验对结果进行确认。 2. 数据 数据应以表格形式出现。所有处理测试和控制对照的培养物都应单独列出其各个分裂中期的SCEs数码数目和各个分裂中期的每个染色体的SCEs数码数目。 应用适当的统计方法对数据进行评估。 3.实验结果报告 3.1. 测定结果报告 如果可能，测定结果报告应包括以下信息。 – 使用的细胞，维持细胞载体的方法。 – 测定情况条件、媒质组成、CO2浓度、测定物质浓度。 使用的载色剂媒介、培育温度、处理时间、使用的纺锤体抑制剂及其浓度和处理持续时间、所使用的哺乳动物活动系统的种类、正负阳性和阴性对照参考物质。 – 单个每个实验点的细胞载体株数 – 载波切片准备的技术细节 – 分