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生化技术 绪论 1定义 生化技术——在生物化学及其相关学科应用的各种技术，主要指生物体内物质及其代谢产物，特别是生物大分子的分离、检测、制备与改造技术。 2发展过程 1923 Svedberg设计超速离心机 1925 Warberg发明微量检压仪 1930 放射性同位素技术在生物化学过程中应用 1931 Kuhn柱层析分离α、β-胡萝卜素 1940 电泳、层析技术 50-52 气相色谱（GC） 1956 Sanger x射线衍射技术确定蛋白质一级结构 1953 Watson、Crick x射线衍射技术 DNA双螺旋结构 1960 操纵子学说 1964 人工合成胰岛素 1969 固定化酶、细胞技术 1973 基因工程 1975 细胞工程（杂交瘤技术） 1990 启动人类基因组计划 1996 “多莉”羊诞生? 第一篇????? 生化分离技术 第一章????? 生物大分子的提取与沉淀分离技术 生物大分子：蛋白质、酶、核酸、多糖和脂类 第一节 细胞破碎 细胞破碎的原因： 破碎的主要方法：机械法、物理法、化学法、酶法 1 机械破碎方法 1.?? 1高速组织捣碎机 原理 操作：装料，低速→高速 效果：作用强烈，活性物质易受破坏 1.?? 2匀浆器 原理： 效果：破碎程度较捣碎机高，破坏较少 1.?? 3研磨器 2 物理破碎 2.1温度差破碎法 2.2压力差破碎法 2.3超声波破碎法 影响因素：样品浓度、超声波频率、功率、破碎时间 操作：冰浴、间歇进行 适用于悬浮细胞破碎 3化学破碎法 原理：化学试剂改变或破坏细胞膜结构 常用试剂：有机溶剂、表面活性剂 4 酶学破碎法 外加酶制剂或自溶法 第二节 提取 1 提取的基本概念与影响因素 提取（抽提或萃取）： 主要影响因素： a 欲提取的物质在所用的溶剂中的溶解度；b该物质向溶剂扩散的难易 溶解度大小：a 溶剂：相似相溶；b 温度 c等电点 2 蛋白质和酶的提取 提取方法：水溶液提取、有机溶剂提取、混合提取 选择方法依据：存在部位、分子结构和溶解性质 2.1水溶液提取 水、稀盐、稀酸、稀碱溶液 常用稀盐溶液和缓冲液，应注意控制盐浓度、温度、pH 2.1.1盐浓度的选择 一般用等渗盐溶液。但根据溶解度，有些蛋白质要用较高浓度盐溶液提取，而有些则用纯水提取。 2.1.2 pH的选择 不在等电点附近，但不宜太高或太低。 pH3~4有利于离子键分离 2.1.3温度的选择 一般0~10℃（常用4℃），对于耐高温的蛋白质和酶，可适当提高温度，可使杂蛋白变性分离，有利于提取和进一步纯化。 2.1.4添加底物或辅酶有利于酶的提取 2.2有机溶剂提取 常用有机溶剂：乙醇、丙酮、丁醇等 注意：蛋白质提取应根据不同蛋白质的不同性质选用不同的提取条件 3 核酸的提取 类化合物都溶于水而不溶于有机溶液，一般用水溶液提取。提取的一般都是核蛋白。 DNA-Pro.与RNA-Pro.在不同浓度电解质溶液中溶解度有明显差别： 0.14mol/L NaCl: RNA-Pro.溶解度相当大，DNA-Pro.溶解度仅为水中1％。 1 mol/L NaCl: RNA-Pro.溶解度小，DNA-Pro.溶解度比水中大2倍。 DNA-Pro.与RNA-Pro.在不同pH下溶解度不同 RNA-Pro. PH2.0-2.5 S最小 DNA-Pro. PH4.2 S最小 应选择不同的条件提取分离DNA-Pro.与RNA-Pro. 3.1 RNA提取 细胞破碎 →水溶 →过滤去渣 →调pH5 → tRNA↓ mRNA，rRNA: 3.1.1 稀盐溶液提取 细胞破碎 → 匀浆0.14 mol/L NaCl→RNA-Pro提取液→分离DNA-Pro、Pro、多糖 RNA：tRNA15%，mRNA5%，rRNA80% 3.1.2 苯酚水溶液提取 细胞破碎 → 匀浆等体积90％苯酚水溶液振荡→RNA、Pro分开→RNA、多糖（水层）； DNA、Pro（苯酚层） 冷酚法、热酚法，注意苯酚除杂 3.2 DNA提取 浓盐法：1mol/L氯化钠溶液提取，＋含少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质 或：先用稀盐除去RNA－Pro，再用浓盐提取 也可用苯酚法，苯酚层得到 DNA、Pro 第三节 沉淀分离 分离纯化：除去各种杂质，获得较高纯度物质的过程 蛋白质和酶分离提纯方法：沉淀分离、层析分离、电泳分离、超离心分离等。 沉淀分离：通过改变某些条件或加入某种物质，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出的技术。包括盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、复合沉淀法、金属盐沉淀法、选择性变性沉淀等。 3.1 盐析沉淀法 蛋白质在水溶液中的溶解度受盐浓度影响