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无机磷对长春花细胞生长和生物碱含量的影响 王宝林 （天津市新家园种苗有限公司，天津300384） 摘 要 以长春花细胞株为供试材料，探讨长春花细胞培养中，培养基无机磷含量对细胞生长与生物碱含量的影响。不同磷含量情况下，高磷含量对长春花细胞增殖有促进作用，但作用不明显。在有促进生物碱合成因素条件下，高无机磷含量对长春花细胞培养物生物碱含量无明显抑制作用。 关键词 长春花 无机磷 细胞培养 生物碱 长春花（Catharanthus roseus）植物因含有价格昂贵的抗恶性肿瘤药物长春碱、长春新碱等生物碱，始终被国内外研究者所瞩目。在土地资源日趋紧张与人类需求日益增长矛盾中，实现长春花植物细胞大规模工厂化生产，脱离天然药物生产对土地资源依赖，是缓解和满足人类需求最有效途径。 氮和磷与植物细胞生长密切相关，在一定范围内增加培养基中氮和磷浓度会促进细胞快速生长，而氮、磷欠缺时细胞生长受到抑制并强烈地刺激次生代谢过程①。本试验以长春花为材料，探讨在低氮条件下，不同磷处理对长春花细胞生长和生物碱含量影响，旨在为长春花细胞深层发酵培养提供培养基配方依据。 材料与方法 细胞株 取材一年生长春花植株中部发育良好叶片，于改良的B5培养基中诱导出愈伤组织，经多次筛选得到优良细胞株系。继代悬浮培养10次以上，改用经过改良的SH生长培养基（含N676 mg·l-1，P270 mg·l-1,蔗糖3%）对细胞株进行3次悬浮继代培养，得到分散良好、脱分化完全、性状基本稳定愈伤组织细胞。 生产培养 以MS培养基为基础培养基，变更添加项见表1。 表1 改良MS培养基成分变更情况 成分 N（mg·l-） IAA（mg·l-1） BA（mg·l-1） L-色氨酸（mg·l-1） 蔗糖（%） 含量 210.00 0.17 1.12 500.00 5.00 P含量分为5个处理，详见表2。 表2 处理组培养基含磷量 处理编号 P1 P2 P3 P4 P5 含量mg·l-1 9.70 19.40 38.80 194.00 388.00 培养瓶容积为250ml,每瓶培养基50ml，接种量为9.17g（折合14.5%）。 细胞干鲜重测定 取一定体积悬浮细胞，置于离心机上，以2000r·min-1离心10min，称其鲜重。将离心后鲜细胞放入90℃烘箱中，至24H取出称得干重。并得到细胞干鲜比。 生物碱总碱测定 取鲜细胞样品1g，加入0.5gNaCl与10ml95%乙醇，用研钵研磨至完全破碎后，4000r·min-1离心10min。取上清液于带塞比色管中，蒸制近干，加入PH为4.6的柠檬酸缓冲液5ml、PH为4.6的0.04%溴甲酚绿溶液2ml、氯仿10ml。震荡3min，然后静置10min。分层后，用吸管吸取5ml下层氯仿液移入另一带塞试管中，加入含有1%NaCl溶液10ml，震荡3min，静置放置10min。分层后取上层水相在721分光光度计上于波长620nm处测定O·D值，用下式计算样品中生物碱含量： ?=O·D·0.00188-1-7.91 式中0.00188为每?生物碱的吸光值，7.91为校正系数。 结果与分析 高磷含量虽然有利于细胞增殖培养，在本试验中增值不明显（表 3）。表中P4磷含量高于P120倍，细胞增长鲜重倍数却仅为1.2，P5磷含量高于P140倍，细胞增长鲜重倍数却仅为1.4。很显然，对于长春花细胞液相化培养中，以生长培养为目的时，培养基中P含量大于10mg·l-1对于细胞产量影响不大。 因此，为降低长春花细胞大规模深层发酵培养生产成本，培养基中磷含量基于10mg·l-1较为适宜。 表3：不同磷处理对细胞生长量和生物碱含量 处 理 编 号 增长细胞鲜重（g·d-1·l-1） 鲜细胞生物碱 含量（?·g-1） 干重生物碱 含量*（%） P5 54.90 337.83 1.16 P4 47.50 353.79 1.22 P3 50.30 301.14 1.04 P2 41.60 385.71 1.33 P1 38.10 518.68 1.79 *鲜细胞的干物质含量为2.9% 增加培养基中无机磷含量，生物碱含量下降（表3）。P1处理生物碱含量最高，为518.68?/g，P2到P5处理，生物碱含量均不同程度低于P1处理。P5处理培养基中无机磷含量超过323mg·l-1，并未出现培养基中无机磷增加对生物碱合成所产生的负影响。 考虑到供试培养基成分中加入了IAA、BA、L-色氨酸等有利于生物碱合成的物质，尤其是L-色氨酸作为吲哚生物碱前体，对生物碱合成起促进作用。