DGGE实验方法及常规分析思路.docVIP

DGGE技术服务介绍 DGGE介绍 使用PCR方法扩增特定环境样品中混合细菌16S rDNA，通过变性梯度凝胶电泳分析环境样品中的细菌群落结构；将凝胶电泳条带回收后克隆测序，确定细菌种属关系，获得特定样品中的细菌多样性信息变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60?℃，变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。??为了提高DGGE的突变检出率，可以人为地加入一个高熔点区——GC夹。GC （GC?clamp）就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。 您需要提供的信息： 1) 环境样本或环境DNA样本。 2) 环境样品及其中的细菌是否具有致病性和潜在危险，如您对样品具有一定的致病性或均有潜在的危险，请您提供样本DNA。 3) 请您提供选择哪儿种方式进行真菌群落结构和真菌多样性进行分析。 4）具体咨询公司销售 刘振 数据分析内容 4.1DNA提取 4.2GCPCR电泳检测结果 4.3DGGE电泳图片 4.4 PCA分析图片 4.5 根据灰度系数构建的香浓多样性指数 表5 DGGE图谱中各样品条带灰度值 Lane Name Band Number Peak Int Lane Name Band Number Peak Int 1 49 184.942 10 20 143.9 1 2 128.249 10 46 108.4 1 3 112.864 10 49 140.3 1 6 121.77 10 57 106.5 1 11 118.23 10 1 112.4 1 12 115.903 10 2 82.98 1 14 135.942 10 3 72.17 表5各样品之间的微生物多样性分析 Shannon Diversity H′ (香浓指数) Jsw E （均匀度指数） Margalef Index S （丰富度指数） 1 3.5743 0.9826 38 2 3.5460 0.9820 37 3 3.4706 0.9842 34 4 3.6646 0.9868 41 5 3.6135 0.9863 39 6 3.6090 0.9783 40 7 3.7063 0.9854 43 8 3.4281 0.9804 33 9 3.5907 0.9801 39 10 3.4246 0.9711 34 11 3.7057 0.9793 44 4.6 示意图 4.7 样本之间的相似系数和聚类 戴斯系数比较PCR-DGGE图谱的相似性 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 100 22.7 55.4 8.9 4.2 6.4 16.6 6.2 0 15.9 3 16.5 2.5 2 22.7 100 33 33.6 6.8 30.4 8.6 33.9 21.1 24.6 23.5 8.2 17.7 3 55.4 33 100 32.1 24 9.4 19.3 11.6 7.3 28 7.6 16.3 9.3 4 8.9 33.6 32.1 100 14.2 31.2 7.4 13.7 12.8 16.7 6.2 16 14.8 5 4.2 6.8 24 14.2 100 4.6 11 22.6 7.3 29 8.9 17.9 4.6 6 6.4 30.4 9.4 31.2 4.6 100 9.1 27.7 16.4 12.2 49.9 24 44 7 16.6 8.6 19.3 7.4 11 9.1 100 5.1 8.2 31.9 4.9 0 10 8 6.2 33.9 11.6 13.7 22.6 27.7 5.1 100 22.9 24.8 53.4 32.6 33.8 4.8 系统发育树分析 4.9 附录 4.9.1 各条带的灰度系数 4.