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核酸的分离与纯化
核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子分开。
在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本的要求；二是尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。
核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料的选择、核酸的释放、核酸与其它生物大分子的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的浓缩、保存等几个主要步骤。
每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。 一、材料的选择
临床常见的标本血液、组织及体外培养的细胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据实验的目的来确定。 二、核酸的释放 （一）机械法 包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可引起高分子量线性分子的断裂，因而不适用于染色体DNA的分离纯化。 （二）化学法
在一定的pH 环境下，加入表面活性剂或强离子剂使细胞裂解，蛋白质和多糖沉淀， 核酸被从细胞内释放出来。向缓冲液中加入一些金属离子螯合剂抑制核酸酶的活性，保护核酸不被降解。 （三）酶法
通过加入溶菌酶或蛋白酶（如蛋白酶K）使细胞破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。
溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-1,4 键水解。蛋白酶K能催化水解多种肽键，且在65℃及有EDTA、尿素和去垢剂如0.5%SDS 或1%Triton X-100 存在时仍保留有酶活性，对于高分子量核酸的提取有很大的优势。 三、核酸的分离与纯化 （一）核酸分离纯化的基本方法 1. 酚抽提法 细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，混匀后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。在含核酸的水相中加入醋酸钾或醋酸钠，形成核酸盐，核酸盐可被一些有机溶剂沉淀，离心得到的核酸可以用70%乙醇洗涤以除去多余的盐分，即可获得一定纯度的核酸。 2. 层析法 包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等。因分离和纯化同步进行，并且有商品试剂盒供应而被广泛应用于核酸的纯化。在一定的离子环境下，核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生物分子分离。 3.密度梯度离心法 双链DNA、单链DNA、RNA 和蛋白质具有不同的密度，因而可经密度梯度离心的方法形成不同密度的纯样品区带，该法适用于大量核酸样本的制备。  氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法是纯化大量质粒DNA 的首选方法。  氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质， 梯度液中的溴化乙锭与核酸结合，离心后 形成的核酸区带经紫外灯照射产生荧光而被检测。用注射针头穿刺回收后，通过透析或乙醇沉淀除去氯化铯而获得纯化的核酸。 （二）基因组DNA的分离纯化 1.生物体组织细胞 2酚抽提法玻棒缠绕法3.基因组DNA粗品4.PFGE分离5.特定的DNA片段6.AGE分离PAGE分离7.乙醇沉淀洗涤8.基因组DNA纯品9.精分离10.粗分离11.前处理12.有机溶剂抽提离子交换层析纯化13.细胞裂解14.蛋白质变性沉淀降解15.DNA释放16.甲酰胺解聚法 哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线 1.酚抽提法
以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA 酶裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要行透析或沉淀处理，获得所需的DNA样品。 一、酚抽提法 主要试剂的作用： EDTA：  二价金属螯合剂，抑制核酸酶；  降低细胞膜的稳定性 SDS的作用：  溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂；  溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；  对RNA、DNA酶有抑制作用；  与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性。 蛋白酶K： 水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质。蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可同时使用。
酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。
PH 8.0的Tris溶液可以使得抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。
在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。 为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，如果直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl饱和酚，并调节至中性。另外使用饱和酚减少酚吸收更多的DNA溶液，降低DNA的损失