蛋白质氨基酸糖鉴的别试验及其比较.docVIP

蛋白质 1.由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。 2.双缩脲反应biuret reaction：蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用形成紫色络合物的呈色反应。在540nm 波长处有最大吸收。可用于蛋白质的定性和定量检测。 　?? 紫色络合物分子结构式 在碱性溶液（NaOH）中，双缩脲（H2NOC－NH－CONH2）能与铜离子（Cu2+）作用，形成紫色络合物（该物质的分子结构式见图），该反应即双缩脲反应。 　　双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一种颜色反应。一般分子中含有两个氨基甲酪基（即肽键：-CO-NH-）的化合物与碱性铜溶液作用，就会形成紫色或蓝紫色络合物。 　　注：除-CO-NH-有此反应外，（-CONH2-）、（-CH2-）、（-NH2-）、（-CS-CS-NH2）等基团亦有此反应。 双缩脲反应的鉴定 　　由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，故可用双缩脲法测定蛋白质的含量（借助分光光度计可减小误差）。 　　双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。双缩脲法的缺点是精确度低、所需样品量大。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如Tris缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。 配制双缩脲试剂的注意事项 双缩脲试剂由NaOH溶液（0.1g/mL）和CuSO4溶液（0.01g/mL）配制而成，配制比例为5:1。但是双缩脲试剂不用现配现用，这是与斐林试剂不同的地方之一！ 蛋白质检测方法比较 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 灵敏度低，使用于0.2-1.0mg氮，误差为±2% 费时，8-10小时，但如果采用凯氏定氮仪，缩短时间至4个小时 将蛋白氮转化为氨气，然后用酸吸收滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定，干扰少，费时，如果采用凯氏定氮仪，就会大大缩短定氮时间 双缩脲法 灵敏度低，1-20mg 中速20-30分钟 多肽键+碱性Cu2+紫色络合物 硫酸铵：Tris缓冲液，某些氨基酸 用于快速测定，但不灵敏，不同蛋白质显色相似 紫外吸收光法 较为灵敏，50-100微克 快速5-10分钟 蛋白质中的络氨酸和色氨酸残基在280nm处有紫外光吸收 各种嘌呤和各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测，核酸的吸收可以校正 考马斯亮蓝法 灵敏度最高，1-5微克 快速5-15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（ 特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色其λmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液，TritonX-100SDS 最好的方法，干扰物质少，颜色稳定，灵敏度高颜色深浅随不同蛋白质变化 Folin酚试剂法 灵敏度高，5微克 慢速40-60分钟 双缩尿反应，磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵，Tris缓冲液，甘氨酸，各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化 氨基酸 茚三酮鉴别试验的反应方程式： 氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。脯氨酸为黄色化合物，谷丙酰胺和天冬酰胺为棕色化合物。 糖分的鉴别实验 Fehling试验?生药的水浸液加Fehling试剂，于沸水浴加热数分钟，若有还原性糖类成分存在，则产生砖红色氧化亚铜沉淀。若有非还原性低聚糖及多糖存在，则必须加稀酸水解后，才能与Fehling试剂呈阳性反应。糖类包括多糖、寡糖、单糖，其中单糖和某些二塘具有有力羰基，是还原糖，多糖和蔗糖没有还原性。 斐林试剂是新配制的溶液，它在加热条件下与醛基反应，被还原成砖红色的沉淀，可用于鉴定可溶性还原糖的存在。 CuSO4 + 2NaOH=====Cu（OH）2 + Na2SO4 2CH3(CH2OH)4CHO + 2 Cu(OH)2 ---（加热）--→ 2 CH3(CH2OH)4COOH+ Cu2O(砖红色沉淀) + 2 H2O Molish试验?生药水浸液，加a -萘酚试剂数滴，摇匀后沿管壁滴加浓硫酸，若有糖类成分与甙类存在，则在二液面交界处出现紫红色环。 紫红色复合物 　　3. 成脎试验?生药