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植物总DNA的提取1
核酸的分离、提取、鉴定与扩增
一.植物总DNA的提取
[实验目的]
核酸的分离纯化是核酸制备及分析的前提和基础,通过本实验将学会和掌握核酸制备的一些基本操作和方法,通过电泳等实验技术研究核酸的性质,同时掌握用PCR技术分析不同材料之间亲缘关系的方法。
[实验原理]
由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同,而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异,因此不同生物采用的提取方法也不同,一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验采用CTAB法提取竹子、香樟的DNA。
植物叶片经液氮研磨,可使细胞壁破裂,加入去污剂(如CTAB),可使核蛋白体解析,然后使蛋白和多糖杂质沉淀,DNA进入水相,再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法,其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂,能溶解膜蛋白与脂肪,也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下, 结合 65℃ 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物,此复合物在高盐(0.7mM)浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0.1-0.5mM NaCl)下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿 / 异戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA,最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。
[实验器材]
1、冰箱
2、恒温水浴锅
3、高速离心机
4、陶瓷研钵和杵子
5、离心管
6、植物材料
7、微量加样器
[实验试剂]1.十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)2. 三羟甲基氨基甲烷(Tris)3.乙二胺四乙酸(EDTA)4. 氯化钠5.2-巯基乙醇6. 无水乙醇7. 氯仿8. 异戊醇2g新鲜的竹子、香樟叶片,用蒸馏水冲洗叶面,滤纸吸干水分。
2、将叶片剪成1cm长,置预冷的研钵中,倒入液氮,尽快研磨成粉末。
3、加入800 μl的CTAB提取缓冲液,混匀(CTAB在65水浴预热),每5min轻轻震荡几次5. 冷却2 min后,加氯仿振荡2~3 min,使两者混合均匀; 10000 rpm离心10 min,移液器轻轻地吸取上清另一新的灭菌离心管中;的异丙醇,将离心管慢慢上下摇动30s,使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物; 10000 rpm离心1 min后,立即倒掉液体,注意勿将白色DNA沉淀倒出 加入800 μl 75%的乙醇,洗涤DNA; 10000 rpm离心30s后,立即倒掉液体,干燥DNA(自然风干或用风筒吹干); 加入50 μl ,使DNA溶解3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶,因此第一步的操作应迅速,以免组织解冻,导致细胞裂解,释放出DNA酶,使DNA降解。 CTAB可使核蛋白体解析,然后使蛋白和多糖杂质沉淀本实验采用CTAB法,其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂,能溶解膜蛋白与脂肪,也可解聚核蛋白。
液氮研磨的原理是什么?
答:液氮变为气体时要吸收大量的热,使叶片瞬间冷冻。这样研磨起来就更彻底,更重要的是这种冷冻的方法不会破坏叶片细胞内所含的物质的形态。 PCR1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明聚合酶链反应具有划时代意义的。其原理类似于DNA的体内复制,只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA ,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合适的缓冲体系,DNA变性、复性及延伸的温度与时间。polymerase chain reaction , PCR)的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增2n倍。
变性:加热使模板DNA在高温下(94℃)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变性阶段。
退火:使溶液温度降至50~60℃,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,即退火阶段。
延伸:溶液反应温度升至72℃,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按5′→3′方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环,即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲,每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。
[实验器材]
PCR热循环仪
tip头、冰盒
PCR管
超纯水
DNA相对分子质量标准物
移液枪
[实验试剂]
1、10×缓冲液
500mmol/l KCl
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