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植物抗旱生理指标测定原理及方法
植物抗旱生理指标测定原理及方法
生命科学学院
杨歌
指标测定:
可溶性糖(蒽酮法)
脯氨酸
丙二醛
叶绿素
蛋白(考马斯亮蓝法)
超氧化物歧化酶(SOD)
过氧化物酶(POD)
谷胱甘肽(GSH)
九、 电导率
可溶性糖含量的测定
1.蒽酮法
1.1原理
糖在浓硫酸作用下,可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物,在可见光吸收峰位620nm。
测定对象:几乎可以测定所有的碳水化合物,而且可以测所有寡糖类和多糖类,其中包括淀粉、纤维素等(反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应,所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量,实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量)。
1.2 步骤
试剂:(1)浓硫酸;
(2)蒽酮乙酸乙酯试剂:蒽酮------------1g
加乙酸乙酯至----50ml
实验步骤:
称取样品0.1g,置于研钵中,加4ml ddH2O研磨成匀浆,8ml ddH2O洗涤研钵。
100°C沸水浴10min,冰上冷却。
4000rpm离心10min。
取上清5ml转移至100ml容量瓶定容。
1ml提取液+ 1ml ddH2O+0.5ml蒽酮+5ml浓硫酸,轻轻混合均匀,100°C沸水浴10min,冰上冷却。
620nm处测吸光值。
1.3 计算方法
可溶性糖含量%?=?C*V/(W*10^6)100%?
V为植物样品稀释后的体积(ml)C为提取液的含糖量(μg/ml)W为植物组织鲜重量(g)问题及质疑:
1.目标糖含量:
标准曲线是用葡萄糖位标准制作的,而蒽酮法是测总糖的量,包括己糖、戊糖,浓硫酸将淀粉、纤维素水解成的单糖,将总糖得出的OD值代入由单一糖做出的标准曲线,有一定误差存在。注:查看所有文献的标准曲线都是用葡萄糖制作。
2.误差分析:
(1)不同糖类与蒽酮试剂反应的显色程度不同。果糖最深,葡萄糖次之, 半乳糖、甘露糖较浅,五碳糖最浅造成误差。
(2)蒽酮试剂溶解度较低,非常容易析出,在反应时加入糖的水溶液中,出现浑浊现象,影响反应进行。(3)介于以上原因,将上清5ml转移至100ml容量瓶定容,稀释程度过大,当糖含量少的时候,大的误差可能会掩盖真实的糖含量。造成品数据没有实际意义。
方案修改意见:
首先,做五到六组空白,测试分光光度计误差程度。
增加平行组数,由三组增加至五组,减少每个样品测试次数。
改变测试样品定容量,由100ml变为50ml。
脯氨酸含量的测定
茚三酮法
1.1原理
在正常环境条件下,植物体内游离脯氨酸含量较低,但在逆境(干旱、低温、高温、盐渍等)及植物衰老时,植物体内游离脯氨酸含量可增加10-100倍,并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。
用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后,溶液即成红色,再用甲苯处理,则色素全部转移至甲苯中,色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色,从标准曲线上查出(或用回归方程计算)脯氨酸的含量。
1.2步骤
试剂:(1)25%茚三酮:茚三酮------------0.625g
冰乙酸------------15ml
6mol/L磷酸--------10ml
70°C水浴助溶;
(2)6mol/L磷酸:85%磷酸稀释至原体积的2.3倍;
(3)3%磺基水杨酸:磺基水杨酸------3g
加蒸馏水至------100ml
实验步骤:
(1)称取0.1g样品放入研钵,加5ml 3%磺基水杨酸研磨成匀浆,100°C沸水浴15min;
(2)冰上冷却,4000rpm离心10min;
(3)提取液2ml+冰醋酸2ml+25%茚三酮2ml混合均匀,100°C沸水浴30min,冰上冷却;
(4)加4ml甲苯混合均匀,震荡30s,静置30min;
(5)以甲苯为空白对照,再520nm下测定吸光值。
计算方法
脯氨酸含量(μg/gFW)= X * 提取液总量(ml)/
样品鲜重(g)*测定时提取液用
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