1现代细胞分子生物学实验技术.docVIP

现 代 细 胞 分 子 生 物 学实 验 技 术 实 验 讲 义 南昌大学药学系 药理教研室 目 录 第一部分 细胞培养 1 第1章 细胞培养的基本概念 1 第2章 细胞培养常用器材的处理方法 3 第3章 细胞的培养 7 第4章 细胞学常用实验技术 10 第二部分 基因克隆常用技术 27 第三部分 RT-PCR 38 第1章 RNA提取原理和方法 38 第2章 RT-PCR原理与方法 45 第3章 RNA提取、RT-PCR实践 49 第四部分 SDS、Western印迹 54 第1章 基本原理 54 第2章 操作步骤（protocol） 61 第3章 Western bloting常见注意事项 77 第一部分 细胞培养 第1章 细胞培养的基本概念 细胞系：原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。 细胞株：通过选择法或克隆形成法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的细胞群。细胞株的这种特定性质或标志必须在整个培养期间始终存在。 克隆：指由同一个祖先细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体。 组织培养：是指把活体的组织取出分成小块，直接置于培养瓶底培养或将胶原纤维血浆支持物铺于培养瓶底来进行培养。其特点是组织不失散，细胞保持原有的组织关系。培养的结果是细胞从组织块周围长出，形成生长晕或形成由扁薄细胞构成的单层细胞培养物。当细胞由组织向外迁移时，组织功能逐渐消失。细胞培养与组织培养两种培养方式相互联系，区别不大。 器官培养：是将活体器官或一部分器官取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特征的培养。其特点是培养的器官在合适的条件下有生长和分化，存活数周至数年。其培养物用肉眼及显微镜观察均受限，只能用组织切片的方法观察或用透射电镜、扫描电镜观察。 细胞培养的优点和作用： 由于其培养的对象是有生命的，所以只要培养条件控制得合适，就能长时间保持细胞的活力，并能长期地观察、监控、检测活细胞的形态结构和生命活动，可用于细胞学、遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学、实验医学等多种学科的研究。 研究的条件可人为地控制。培养过程中可根据研究需要施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验研究、观察；可用于药理学、毒理学等学科的研究工作。 体外培养的细胞可采用各种技术和方法，如显微镜、激光扫描共聚焦显微成像技术等来观察、检测和记录，直接观察活细胞的变化，分析细胞的超微结构，检测细胞内物质的合成、代谢的变化等。 研究的范围广泛。培养的细胞来源很多，从低等生物到哺乳动物以及人类，从胚胎到非导体，从正常组织到肿瘤细胞。 由于细胞培养可以在同一时期、相同条件、相同性状的条件下提供大量的实验样本，所以保证了实验的可重复性，而且相对耗资较少。 细胞培养技术也存在一定的局限性，如细胞或组织生长在人工培养环境中，与体内环境相比仍然存在一定的差异，培养的细胞或组织，其形态或功能会发生不同程度的改变。因此在利用培养细胞做实验对象时，不能将其与体内细胞完全一样看待，只能把它们视作一种既保持动物体内原细胞一定的性状，同时结构和功能又发生某些改变的特定的细胞群体。尤其须注意反复传代、长期培养者，可能发性染色体非二倍体改变等情况。尽管细胞培养有诸如此类的不足，但仍不失为研究活组织和活细胞的一种良好的方法。利用这一技术，可进行多方面的研究。 细胞培养常用器材的处理方法 一）玻璃器材 1. 首次使用的玻璃器材的处理步骤 1）自来水初步刷洗； 2）稀盐酸溶液（1%）浸泡过夜 3）自来水冲洗 4）处理方法与重复使用的器皿相同。 2. 重复使用的玻璃器皿的处理步骤 1）涮洗。用软毛刷和优质中性洗涤剂涮洗，去除器皿内外表面的杂质。涮洗时注意不要用力过重，以防损坏器皿内表面光洁度，影响细胞生长；也不能留有死角。 2）清洁液处理。将涮洗晾干后的玻璃器皿放入硫酸-重铬酸钾清洁液中。清洁液配方见表1。一般浸泡12-24小时后取出。 清洁液配方3）清洗。从清洁液中取出的器皿用自来水冲洗10次以上，再分别过一蒸水、二蒸水和三蒸水各冲洗一次。 4）晾干。 5）灭菌。一般用121℃高压蒸汽灭菌20min。 二）塑料器材 1) 先用自来水浸泡冲洗、晾干。 2）再用3%盐酸或2%氢氧化钠溶液浸泡过夜，用自来水充分冲洗，或先用2%氢氧化钠处理之后再用3%盐酸浸泡30min.。 3）最后用自来水冲洗干净，并用双蒸水冲洗3次以上，晾干。 4）消毒采用紫外线直接照射或辐照灭菌办法灭菌。 三）橡胶器材 1. 新购置橡胶制品的处理 1) 用自来水冲洗去除其表面粉粒和污物。 2) 用5%氢氧化钠煮沸15min，用自来水冲洗8次。 3）用4%盐酸煮沸15