2011AS1.398中性蛋白酶生产条件的优化及活力的测定供参习.docVIP

实验四 AS1.398中性蛋白酶生产条件的优化及其活力的测定 目的 熟悉微生物酶制剂的生产过程 掌握酶活力的检测方法 掌握确定最佳培养条件的方法 原理 中性蛋白酶为水解酶的一种，可以将蛋白质水解成为氨基酸，是我国蛋白酶产量最大的酶制剂品种，主要应用于皮革加工工业和食品工业。本实验使用枯草杆菌AS1.398在实验室中模拟发酵生产中性蛋白酶酶制剂过程，确定以玉米粉、豆饼粉等为碳源氮源的培养基配方等最佳产酶条件。 主要仪器和材料 摇床、培养箱、冰箱、灭菌锅、超净工作台、低速离心机、722-2000分光光度计、1/100天平、水浴锅、电热炉。 枯草杆菌AS1.398、葡萄糖、玉米粉、豆浆、牛肉膏、蛋白胨、稀盐酸、氢氧化钠、酪氨酸标准液（100μg/mL，0.2 mol/L盐酸配制）、2%酪素（用pH=7.5磷酸缓冲液溶解）、0.4mol/L三氯乙酸、碳酸钠溶液（0.4mol/L）、folin-酚试剂（1N）。 四、操作步骤 （一）培养基的制备及灭菌 液体细菌培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，调节pH7.2-7.4 灭菌：115℃，30分钟。 摇瓶培养基 基础培养基：KH2PO4 1.0g , Na2HPO4 2.0 g , MgSO4·7H2O 0.8g , 牛肉膏0.7g（每1000ml）。 碳源：玉米粉4%，葡萄糖2%，氮源：豆浆3%，4% （二）培养 1、菌种活化：取保存枯草杆菌斜面，转接于空白斜面上，37℃培养36h。 菌种一级扩大培养：取一环菌种接于装有100ml液体牛肉膏蛋白胨培养基的250ml的三角瓶中，37℃培养48小时。 摇瓶发酵培养：取1ml菌液分别接于A（牛肉膏蛋白胨）、B（葡萄糖2%，豆浆3%）、C（葡萄糖2%，豆浆4%）、D（玉米粉4% ，豆浆3%）、E（玉米粉4% ，豆浆4%）液体培养基中，调节培养基的pH值为7.4，37℃、240r/min培养36h。 （三）酶活力的测定： 1、发酵液离心：1200r/min离心20min，取上清酶液A、B、C、D、E。 2、不同培养基的酶活力测定： 样品：取5只小试管，分别加入1 mLA、B、C、D、E酶液(先于40℃水浴中预热3分钟)，每个三角瓶中再加入1 mL 酪蛋白溶液（先40℃预热3分钟），摇匀，在40℃水浴中精确反应10min，立刻加入3mL 三氯醋酸，摇动，静置10min，滤纸过滤，用小试管收集滤液，放置10min。 另取5只10mL具塞刻度试管，分别加入1.0mLA、B、C、D、E过滤液、每管再依次加入5ml 0.4M Na2CO3、1.0mL folin-酚试剂，摇匀，40℃水浴20min，冷却，680nm 波长比色。 空白：取5只小试管，分别加入1mLA、B、C、D、E酶液、每管再加入3mL三氯醋酸，混合后加入1mL酪蛋白，振荡，过滤，收集滤液。 另取5只10mL具塞刻度试管，分别加入1.0mL上述过滤液，每管再依次加入5ml 0.4M Na2CO3、1.0mL folin-酚试剂，摇匀，40℃水浴20min。 酪氨酸标准曲线的绘制： 取8只小试管，按下表操作。绘制标准曲线，做出回归方程。 编号 1# 2# 3# 4# 5# 6# 7# 空白 标准溶液 ml 0.2M HCl ml 0.4M Na2CO3ml Folin液 ml 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0 1.0 5.0 1.0 40℃水浴，20min 冷却 680nm 波长比色 标准液μg OD 10 20 30 40 50 60 70 0.109 0.214 0.320 0.439 0.520 0.613 0.708 Y=0.01067+0.01013x R2=0.99767 五、结果处理 以40℃、pH7.2条件下，粗酶液分解酪素每分钟产生1μg酪氨酸定义为一个酶活力单位。汇总全班数据，比较各培养基的优劣。 （ K为标准曲线的斜率的倒数） 六、实验分组 每组5人，每班6组。 附表1 实验试剂 实验试剂 用量 实验试剂 用量 酪氨酸标准液（500μg/mL） 每班100mL 0.2M HCl 每组1