6第六章基因克隆操作过程讲义.ppt

（2）细菌原生质体的转化 适用对象：革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等），其接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常去除细胞壁后再进行转化，这与酵母菌、霉菌、植物细胞等类似。 细菌原生质体的制备：不同细菌的原生质体制备方法不尽相同。以链霉菌为例，细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水、无去污剂。 细菌原生质体的转化：由PEG和Ca2+介导 细菌原生质体的再生：原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素。 * * 基因克隆操作过程 （3）λ噬菌体DNA的转染 感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600 = 0.5。 吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟。 转染裂解：加入20倍体积的新鲜培养基，30℃继续培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。 * * 基因克隆操作过程 （4）电穿孔转化 原理：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。 特点：电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。 * * 基因克隆操作过程 （5）酵母的转化一般有以下两种方法： 利用酵母的原生质球进行转化 利用Li+盐进行转化 （6）植物细胞的转化及其他基因转移方法 叶盘法 电击法 基因枪法 （7）哺乳动物细胞基因导入法 磷酸钙沉淀法 脂质体载体法 显微注射法 DEAE葡聚糖转染技术 * * 基因克隆操作过程 2.转化率 （1）转化率的定义 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。 由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，能够接纳DNA的受体细胞数目，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞无法生长）。 * * 基因克隆操作过程 例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108 ，意味着 每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。 一微克pUC18共有3.4×1011个分子，也就是说，每3400个pUC18分子中才有一个分子进入受体细胞。 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2mL感受态细胞，大约含有2×1010 个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞中只有一个细胞能接纳pUC18 DNA。。 * * 基因克隆操作过程 （2）转化率的用途 利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模。 例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/μg载体，经切、接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？ （1）若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要： 104/（107/μgX 10-2）= 0.1 μg 载体DNA （2）考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0.5 μg 载体DNA （3）载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算出（5 μg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选。 * * 基因克隆操作过程 （3）转化率的影响因素 载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级。 插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。 受体细胞：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高。 供体、受体的比例： Ca2+诱导转化 0.1ml 感受态细胞 50ng DNA 原生质体转化 109 个原生质体 50ng DNA 转化方法：Ca2+诱导转化：106-107/μg DNA 原生质体转化：105-106/μg DNA λ-DNA转染： 107-108/μg DNA 电穿孔转化： 106-109/μg DNA * * 基因克