2010CB126300重要养殖鱼类功能基因组和分子设计育种的基础研究.docVIP

项目名称： 重要养殖鱼类功能基因组和分子设计育种的基础研究 桂建芳 中国科学院水生生物研究所 2010年1月-2014年8月 中国科学院 湖北省科技厅 二、预期目标 本项目的总体目标： 针对水产养殖业发展现状和可持续发展需求，通过开展重要养殖鱼类生殖、生长和抗性等主要经济性状的功能基因组研究，解析鱼类生殖的基因调控网络、鱼类生长的基因调控网络、鱼类抗病和抗寒的基因调控网络，筛选鉴定进行分子设计育种的主控或关键基因和分子标记，建立鱼类分子设计育种的关键技术及其技术体系，在理论上阐明鱼类生殖、生长、抗病和抗寒等主要经济性状和重要生命现象的基因调控网络及其作用机理，提出鱼类良种分子设计的策略；在技术方法上，建立鱼类分子设计育种的多基因聚合和基因操作技术，创制优质育种材料，创建鱼类分子设计育种的可行性途径。通过这些研究，使我国在鱼类功能基因组研究中居国际领先水平，为培育高产优质养殖新品种奠定理论和技术基础，为我国水产养殖业的可持续发展和渔业生物技术的创新做出贡献。 五年预期目标: 解析鱼类生殖、生长、抗病和抗寒的基因调控网络； 筛选鉴定具有自主知识产权、可用于鱼类分子设计育种的功能基因和分子标记30－50个； 揭示鱼类性别决定与分化、卵母细胞成熟和卵-胚转换的分子机制； 阐明鱼类生长激素分泌的信号通路； 阐明鱼类干扰素系统关键基因和重要抗菌基因的抗病功能及其作用机理；阐明鱼类抗寒关键信号通路及其作用机理； 建立鱼类数量性状多基因聚合育种技术； 创建基于蛋白分子设计和遗传安全的稳定高效的基因操作技术； 建立主要经济性状功能基因组研究和分子设计育种中间的有机联系，创制2－3个在生殖、生长 或抗性等目标经济性状上表现优质的育种材料； 凝聚和培养一批有国际影响的中青年学术带头人和学术骨干；发表一批高质量的学术论文，其中在有重要国际影响的期刊（相关领域引用排名前15%的期刊或影响因子大于5的期刊）发表论文50篇以上。 三、研究方案 （一）、学术思路： 针对水产养殖业发展现状和可持续发展需求，以鲫和鲤等为主要研究对象，启动我国重要养殖鱼类功能基因组和分子设计育种的基础研究，通过研究鱼类生殖、生长和抗性的基因调控网络及其作用机理，筛选鉴定进行分子设计育种的关键基因和分子标记，建立鱼类分子设计育种的关键技术及其技术体系，解决鱼类分子设计育种的策略和理论基础以及鱼类分子设计育种的可行性途径这两个关键科学问题，为鱼类分子设计育种的实践和应用以及为我国水产养殖业的可持续健康发展和渔业生物技术的创新做出贡献。 （二）、技术途径： 1. 采用solexa深度测序等大规模测序和基因芯片分析等手段，通过比较转录组学分析，了解鱼类生殖和生长不同阶段、以及抗病和不抗病、耐寒和不耐寒的基因表达谱差异，经生物信息学比较和分子特征分析，由此筛选调控鱼类生殖、生长、抗性的主要基因和关键基因； 2. 建立重要鱼类基因组BAC库，研究基因的结构，克隆分离相应基因的启动子；将其启动子与GFP报告基因重组融合，利用基因转移等技术，采用流式细胞仪等筛选分析技术，进一步研究生物学功能； 3. 建立鱼类BAC转基因技术，用杂交方法或PCR方法筛选重要功能基因的BAC克隆，在基因编码框的适当位置插入绿色荧光蛋白（EGFP）基因；利用以上构件制备转基因鱼，通过EGFP分析这些基因的时空表达情况及其生理学效应； 4. 通过基因连锁分析和原位杂交等技术，研究目的基因在染色体上的定位，揭示基因相互作用的基因组组织基础； 5. 用RT-PCR、原位杂交和Western blot方法在mRNA及蛋白水平上检测基因表达的组织特异性和时序性;用免疫荧光定位确定其基因的蛋白产物的组织、细胞和亚细胞定位； 6. 采用染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation，ChIP）、凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）等技术研究DNA与蛋白的相互作用； 7. 采用免疫共沉淀（Coimmunoprecipitation， Co-IP）、GST-pull down、荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）、双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）等技术研究蛋白相互作用； 对一些重要蛋白进行质谱分析、并对其进行泛素化、乙酰化和磷酸化等修饰分析； 8. 鉴定两性生殖鲫鱼卵子中双亲特异性甲基化、发育不等性基因，分析单性生殖鲫鱼三倍体卵子中相关同源基因启动子CpG岛甲基化差异和基因表达调节差异，确定发生差异甲基化的目标基因；比较分析两性生殖与单性生殖