苹果、橘子、香蕉中可溶性糖和蛋白质的提取及含量测定.docVIP

苹果、橘子、香蕉中可溶性糖和蛋白质的提取及含量测定 　　[摘 要]糖类和蛋白质是构成植物体的重要成分，也是新陈代谢的主要原料。不同的水果中糖和蛋白质的含量不同。因此可通过对水果可溶性糖和蛋白质的测定，了解和鉴定其品质的优劣。本实验以苹果、橘子和香蕉为实验材料，通过考马斯亮蓝G-250染色法和蒽酮法测定水果中可溶性蛋白质、糖的含量，测定结果如下：每100g苹果、橘子、香蕉的可溶性糖含量分别为0.616ug，0.565ug，0.596ug；每一克苹果、橘子、香蕉的蛋白质含量分别为0.475mg，0.480mg，0.883mg。 　　[关键词]苹果、橘子、香蕉； 可溶性蛋白质；可溶性糖；考马斯亮蓝；蒽酮 　　中图分类号：O629.7 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）18-0283-01 　　一、实验原理 　　考马斯亮蓝G-250法是利用蛋白质-染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。 　　考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 　　蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质?C染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。 　　糠醛或羟甲基糠醛进一步与蒽酮试剂缩合产生蓝绿色物质，其在可见光区620nm波长处有最大吸收，且其光吸收值在一定范围内与糖的含量成正比关系。 　　此法可用于单糖、二糖和多糖的含量测定，并具有灵敏度高，简便快捷，适用于微量样品的测定等优点。 　　二、实验材料、试剂与器材 　　1、材料和试剂 　　材料：苹果、橘子、香蕉； 　　试剂：①200？g/ml标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至500ml②蒽酮试剂：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光处贮藏③浓硫酸④考马斯亮蓝试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml90%的乙醇中，，加入100ml85%（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1000ml，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。⑤标准蛋白质溶液（100？g/m牛血清蛋白）：称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100ml，吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml即可。 　　2、实验器材 　　分光光度计、离心机、研钵、烧杯、试管、天平、恒温水浴锅、三角烧瓶、容量瓶等。 　　三、实验步骤 　　1、植物组织中可溶性糖的测定 　　⑴、葡萄糖标准曲线的制作 　　取7支200ml具塞试管，编号，按下表数据配置一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。在每支试管中加入5ml蒽酮试剂，再缓慢加入5ml浓硫酸，摇匀以后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟刻度试管中，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，侧个股铵溶液的光吸收值，以标准葡萄糖含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，做出标准曲线。 　　⑵、样品中可溶性糖的提取 　　苹果、橘子、香蕉各称取1g，剪碎，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆然后转入20ml刻度试管中，用10ml蒸馏水分洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。置沸水浴中加盖煮沸10分钟，冷却后过滤，滤液收集于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。 　　⑶、糖含量的测定 　　用移液管吸收1ml提取液于20ml具塞刻度试管中，加上1水和0.5蒽酮试剂。再缓慢加入5浓硫酸，盖上试管塞后，轻轻摇匀，再置沸水浴中10分钟（比色空白用2蒸馏水和0.5蒽酮试剂混合，并一同置于沸水浴中保温10分钟）。冷却至室温后，在620nm波长下比色，记录光吸收值。查标准曲线上得知对应的葡萄糖含量（μg） 　　⑷、实验结果 　　多糖标准曲线的绘制： 　　测得标准曲线的方程为：y=0.0012x+0.0008 　　样品糖含量=样品含量（ug）*稀释倍数*100/{样品重（g）*}g/100g鲜重 　　2、植物组织中可溶性蛋白质含量的测定 　　⑴蛋白质标准曲线的绘制 　　取6支试管，按下表加入试剂，摇匀，向各试管中加入5考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置五分钟左右，以1号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 　　⑵样品提取 　　分别称取1g苹果、橘子、香蕉，用缓冲液研磨成匀浆后，5000r/min离心10min，