皂角刺总黄酮诱导肝癌HepG2细胞凋亡的实验研究.docVIP

皂角刺总黄酮诱导肝癌HepG2凋亡的研究贵阳中医学院550005） 摘要: 目的： 探讨皂角刺总黄酮诱导肝癌HepG2凋亡。方法：应用流式细胞术分别检测肝癌HepG2线粒体跨膜电位皂角刺总黄酮CD3+、CD4+、CD8+及NK 细胞的百分含量并检测血清中IL-2 和TNF-α 的浓度。结果 皂角刺总黄酮皂角刺总黄酮CD3+（P＜0.05）、CD4+（P＜0.05）、CD8+（P＜0.05）及NK 细胞（P＜0.01）的百分含量及血清中IL-2 和TNF-α（P＜0.01）的表达水平。结论 皂角刺总黄酮诱导肝癌HepG2凋亡可能与线粒体通路和干预机体免疫功能诱导肿瘤凋亡，从而达到抑制肿瘤生长起作用。 皂角刺总黄酮线粒体跨膜电位肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,占全部恶性肿瘤的41% [1]。在城市仅次于肺癌,在农村仅次于胃癌我国肝癌已上升为恶性肿瘤的第二位[2]。原发性肝癌病隐匿, 迅速展,生存期短。,手术是早期肝癌治疗的首选方法,放疗化疗则是中晚期肝癌及转移性肝癌常用的治疗方法。然而, 手术;而放疗化疗伴有明显的毒副反应[3]。而以中医药为主的综合治疗,对控制肝癌患者病情发展,生活质量,延长生存有着重要。因此，寻找高效低毒的中医药已经成为国内外医药学家追寻的目标。皂角刺 (Gleditsia sinensis Lain)是我国传统中药材具有的抗肿瘤作用，已被列为抗癌中草药之一可用于多种肿瘤的治疗。皂角刺总黄酮是皂角刺的提取物, 广泛存在于许多药用植物中, 具有多种潜在的药用价值, 其抗肿瘤作用的研究已经由来已久, 从20 世纪70年代起就有人发现黄酮类化合物具有较好的抗肿瘤作用[4]。据研究报道：黄芩甙能诱导肝癌细胞BEL27402凋亡和半枝莲提取物可有效诱导肝癌H22细胞凋亡,其机制可能与降低肿瘤细胞线粒体膜电位有关[6]。(TNF) 的情况, 发现皂角刺总黄酮对TNF 有明显的抑制作用[7]。 1材料与试剂 小鼠，雌雄各半，15～18g，购自贵阳医学院实验动物中心；CD3+ 、CD4+ 、CD8+ 抗体及成套试剂盒,购自美国RD公司interleukin-2（IL-2）、tumor necrosis factor－α（TNF-α）放免试剂盒，购自购自北京华英生物技术研究所TUNEL检测试剂盒, 购自罗氏公司；皂角刺总黄酮RPMI- 1640培养液, 购自凯基生物科技发展有限公司; 新生胎牛血清,购杭州四季青生物公司123染色试剂盒, 购自南京凯基生物科技发展有限公司；BD FACS -Aria流式细胞仪, 美国BD公司生产线粒体膜电位的检测1.1.1 细胞培养及分组用含10%RPM I-1640培养液, 在5% CO237℃培养箱中。实验设空白对照组和经皂角刺总黄酮处理的实验组, 随机选取对数期生长的肝癌HepG2分成5份, 其中4份分别加入皂角刺总黄酮溶液使其终浓度分别为0, 0.8, 1.6, 3.2 mg/ml作为实验组。其中1份, 加入与实验组等量的培养液作为对照组。 1.线粒体膜电位的检测两组细胞孵育24 h后, 经消化用冷PBS悬浮。取细胞数为1×106/mL离心管内离心, 冷PBS洗涤3次移至流式测定管内离心,用100 ?? l结合缓冲液悬浮细胞。随后加入罗丹明123染液10g /mL ,置于 37℃ 5% CO2 培养箱孵育20 min, 取出离心培养液洗涤2次, 上流式细胞仪检测。实验重复3次。1.2 皂角刺总黄酮瘤小鼠免疫HepG2传代第7d的小鼠腹水2 mL，在无菌条件下，采用灭菌生理盐水配制成浓度为2×107个/mL 的接种用瘤液。20只小鼠皮下注射接种用瘤液0.2 mL。 1.2.2 动物分组及指标检测 将20只皮下注射接种用瘤液的小鼠随机分为对照组和给药组，另外设10只正常小鼠作为正常组，对照组和正常组均用生理盐水进行灌胃，用药组采用皂角刺总黄酮0.25 g／kg剂量进行灌胃， 对照组、正常组和用药组均每日灌胃2 次。灌胃给药5 d 后眼球采血法获得外周血，具体操作参照试剂盒说明书采用流式方法检测CD3+ 、CD4+ 、CD8+ 及NK 细胞的百分含量和采用放射免疫方法检测血清中IL-2、TNF-α 的水平。 1.3 统计学处理 所有实验数据均采用SPSS15.0软件进行统计分析，数据采用（x±s）表示。 3 结果 3.1 线粒体跨膜电位的检测 皂角刺总黄酮肝癌HepG224h, 经罗丹明123染色后采用流式细胞仪检测。结果显示: 与对照组相比，皂角刺总黄酮,有极显著差异(P 0. 01), 且随皂角刺总黄酮,呈为负相关，结果见表1。 表1 线粒体跨膜电位的检测结果(x±s) 组别 含量(mg/L ) 阳性数 对照组 用药组 0.4 0.8 1.6 3.2 85.26±1.46