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实验1 复方罗布麻片中山奈酚的含量测定 [实验目的] 1.掌握Waters2695型高效液相色谱的操作方法。 2.掌握用高效液相色谱测量主要化合物含量。 [实验原理] 复方罗布麻片是复方中药制剂，临床用于降血压，罗布麻叶是该复方君药（主要药材），山奈酚是主要活性物质，因此检测复方罗布麻片中山奈酚含量对该药品的质量控制起到重要的作用。山奈酚结构如图1所示。 图1 山奈酚结构 高效液相色谱法是一种分离和检测方法，由进样系统，色谱柱，流动相泵和检测系统组成，主要用于单体化合物的分离和检测。 高效液相色谱系统分离的关键部分是固定相和流动相。固定相为固体，用于吸附物质，流动相由乙腈和水组成，乙腈是有机溶剂，极性偏弱，洗脱能力强，水极性强，洗脱能力弱。通过调整乙腈和水的比例，以控制流动相的洗脱能力，首先将极性化合物洗脱出来，之后再将弱极性化合物洗脱出来，以达到分离化合物的目的。 试验过程中，首先，仪器将样品溶液注入色谱柱内，色谱柱内的C18硅胶会将样品吸附在色谱柱内的前端，以乙腈和水作为流动相，洗脱色谱柱内的化学成分。柱内的化学成分会依据极性大小而被逐个洗脱出来。不同的进样量会产生不同的峰面积。因此，以山奈酚对照品的进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。通过样品的峰面积计算样品中山奈酚含量。 山奈酚对照品及样品高效液相色谱图如图2和图3所示 [仪器与试剂]Waters2695高效液相色谱仪（美国，Waters公司）； 超纯水（18.2?pa），实验室自制，（德国，Siemens公司）； 旋转蒸发仪（日本，EYELA公司）； BS-124S电子天平（德国，Sartorius AG公司）； 乙腈和醋酸为色谱纯（美国Thermo-Fisher公司） 乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和乙酸等为分析纯试剂（北京化工厂）； 复方罗布麻片购自北京同仁堂长春店。 [实验步骤] 样品溶液和对照品溶液的制备：用天平称取2 g样品，用甲醇定容至100mL量瓶中，备用，制得0.02g/mL样品溶液。精密量取4 mg山奈酚对照品，用甲醇定容至10 mL量瓶中，制得0.4mg/mL对照品溶液。 将上述两份溶液过0.45 μm 微孔滤膜，滤至液相色谱瓶中，备用。 高效液相色谱法检测对照品及样品溶液：首先建立高效液相色谱分析方法，设置的参数包括：温度：30 oC，洗脱时间：5 min，洗脱方法：乙腈(A)：0.05%醋酸溶液(B)=55:45，等度洗脱模式，流动相流速1.0 mL/min。对照品进样量分别为：1 μL、2 μL、3 μL、4 μL和5 μL，以进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线。 样品进样量为10 μL，通过液相色谱保留时间识别样品中山奈酚，读取峰面积，代入标准曲线中，计算样品中山奈酚含量。 [思考题] 1.为什么在流动相中加入乙酸。 2.高效液相色谱的梯度洗脱和等度洗脱的区别是什么，并阐明各自的优点和缺点。 1. 进一步掌握高效液相液相色谱原理和操作方法 2. 测量主要化合物含量。 [实验原理] 香兰素是一种人工合成香料，化学名称：4-羟基-3-甲氧基苯甲醛。结构式如图1所示。 图1 香兰素结构式 该香料稳定性优良，可安全地用于食品、饮料、化妆品的增味剂和调味剂。据欧盟专家委员会2000年2月24日报导，大剂量可导致头痛、恶心、呕吐、呼吸困难，甚至损伤肝肾等。因此检测食品中香兰素的含量至关重要。试样加入蒸馏水溶解，提取液以乙酸乙酯萃取，取上层溶液，蒸干，用甲醇溶解，滤过后进样，经高效液相色谱分析，根据液相色谱峰面积进行香兰素含量检测。 [试剂与仪器] Waters2695高效液相色谱仪（美国，Waters公司）； 超纯水（18.2?pa），实验室自制，（德国，Siemens公司）； BS-124S电子天平（德国，Sartorius AG公司）； 乙腈和醋酸为色谱纯（美国Thermo-Fisher公司） 乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和乙酸等为分析纯试剂（北京化工厂）； 香兰素对照品。 [实验步骤] 1、试样前处理 糖果：称取1块，记录质量（g），放入小烧杯中，加入40mL蒸馏水，60oC水浴加热并搅拌30分钟，冷却，用40mL乙酸乙酯萃取1次（除去糖分），上层溶液蒸干，用甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀，溶液经0.45μm滤膜过滤，进行HPLC分析。 2、高效液相色谱测定 (1). 高效液相色谱检测条件： 色谱柱：Waters-C18(4.6mm×150mm, 5 μm)；流动相：甲醇（A）:0.5%乙酸溶液(D)（60:40）；流速：1.0mL/min;检测波长：230nm，运行时间：6min。 (2).含量测定 取标准使用液，置高效液相色谱仪中，分别进样1μL (100 ng), 2μL (200 ng)