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实时荧光定量PCR (Real time Quantitative PCR) 专 业： 生物化学与分子生物学 姓 名： 王梦圆 学 号： 2013211026 1、定义 2、概念和原理 3、染料 定义 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反 应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累 实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析的方法。 常规PCR结合电泳分析方法的局限性 只能对终产物进行分析，无法对起始模板准 确定量 必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析， 费时费事 无法对扩增反应实时监测 实时荧光定量PCR （Real-time PCR）技术 于1996年由美国Applied Biosystems公司推 出，由于许多情况下，我们所感兴趣的是未 经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我 们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数 或者某一特定基因在特定组织中的表达量。 在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。 主要亮点 实时 定量 怎样实现实时定量？ 这是应为在PCR反应体系中加入了荧光基 团，利用荧光信号的积累实现实时监测整 个PCR进程，借助RT-PCR仪绘制出的曲线 对起始模板进行定量分析。借助荧光物质示 踪扩增产物量的变化。 RT-PCR中重要概念和原理 扩增曲线： 荧光扩增曲线可以分成四个阶段： 荧光背景信号阶段 荧光信号指数扩增阶段 荧光信号线性扩增阶段 平台期 重要概念和定量原理 扩增曲线： 基线:在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号 被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物 量的变化。 荧光阈值：荧光阈值是在荧光扩增曲线上人 为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指 数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光 域值的缺省设置在 3-15 个循环的荧光信号标 准偏差的 10 倍。 CT值：每个反应管内的荧光信号到达设定的 域值时所经历的循环数被称为 CT 值 （ threshold value ） 染料 实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和 非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异 杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针 类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来 指示扩增产物的增加。前者由于增加了探针 的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易 行。 TaqMan 探针是多人拥有的专利技术。TaqMan 探 针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩 增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物 之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端， 而淬灭剂则在 3’ 末端。当完整的探针与目标序列配 对时，荧光基团发射的荧光因子与 3’ 端的淬灭剂接 近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外 切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂 分离而发出荧光。 分子信标（molecular beacon）——原理 分子信标是一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记 寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团 与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团 被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过 程称为荧光谐振能量传递（ FRET ）。分子信标的茎环结构 中，环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一 般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连 接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须 非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成 茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子 信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开而发荧光。 Thank you！ * PCR反应混合物 Mg2+ Mn2+ dCTP dGTP dTTP dATP Taq DNA多聚酶 引物 模板DNA 或 缓冲液 荧光物质 Cycle（循环数） Rn（荧光强度） Baseline 荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段 真正的信号:荧光信号超过阈值 Threshold 荧光阈值 平台期 Lg－liner phase Cycle（循环数） Rn（荧光强度） Ct va