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AKTA仪器培训及仪器维护管理计划 仪器负责人：程岚军 2012.10.20 AKTA仪器 AKTA分类：AKTA Purifier 几大层析技术： 柱子信息 仪器系统补充 系统软件：与360、卡巴斯基对仪器系统稳定性有影响。可以用金山词霸或诺顿 收集器有时不转问题：使用完之后把感应器归为到中间的自然状态；EP管盖子剪掉；可以换5ml细长的EP管 UV汞灯使用：额定为2000h，用了4800h，状态参数还可以，暂时不需更换！（check里面有两个参数可以看出） 压力偏高：在线滤器堵了，更换，用1MNaOH超声；Inlet滤膜堵了，刷子清洗；压力传感器校正；柱子问题，NaOH冲柱子 AKTA使用的柱子，当有标记流速箭头的柱子，切记不可反冲！ 基线不稳定：柱子底部筛网膜堵了，可以接反压阀解决；溶液配制问题，更换超纯水观察基线是否稳定；紫外流通池脏了，有气泡，用NaOH冲洗。 自动编程和数据保存备份。及时备份拷走数据！ 分子筛主要根据分子大小； 离子交换根据电荷差异大小，电性； 疏水层析根据疏水性； 反相层析也是根据疏水性，主要分离肽和小分子； 亲和层析根据蛋白特异性结合，选择性最高！ 凝胶过滤层析技术GF 分子筛主要根据分子大小和形状差异进行分离的一种简单可靠的层析技术。其中填料95%为水，其余为Agarose琼脂糖凝胶。空间排阻原理，大分子先洗出，小分子后洗出。 由于蛋白和填料之间可能存在非特异性吸附，所以在流动性中需要加入150mM NaCl。 如何得到满意的结果 使用选择性最高的填料（Superdex 75）：葡聚糖和琼脂糖交联而成；高选择性，高分辨率；速度快，吸附最低，收率高；化学性质稳定；流速快，耐压性能好 使用预装柱 尽量使用粒径小而均一的填料 合理的进样量/柱高（组分离：25%CV，短；精细分离：0.5-5%CV, 30-100cm） 注意样品黏度 降低流速以改善传质速度（通常5-20cm/h） 流动相中使用150mM NaCl 亲和层析技术 如酶和底物、抗原和抗体的非常专一的相互作用。将配基固定在填料上，就可以结合相应的生物分子，再采用合适的方法使之解离。 Ni柱纯化 结合缓冲液中低浓度咪唑的作用 金属离子和组氨酸标签的亲和力 总结Ni Sepharose 结合载量高，纯化同样的蛋白需要的介质量少，成本低； 具有更低的Ni2+脱落保证了多次重复纯化仍能够保持可靠的载量 纯化时，结合缓冲液中咪唑浓度推荐用20-40mM，可以进一步优化5mM 补充说明几个标签蛋白的纯化特点 离子交换层析技术 HiTrapTM SP XL; HiTrapTM Q XL Source基架——人工合成的聚苯乙烯/二乙烯苯填料：特点：化学物理稳定性好，高流速，低反压 SepharoseTM填料——琼脂糖基架 高分辨率 高流速 超高高载量 高流速 选择缓冲液需要注意的问题 用和离子交换填料带有同样电荷的缓冲液 用相同的离子来调节缓冲液的pH（引入其他离子） 在添加盐后再调节pH（加盐和不加盐pH变化） 在工作温度下调节pH 在运行中监测pH和电导 空白运行！ 疏水层析 疏水层析是一种液相吸附层析，依据生物分子之间疏水性的差别来进行分离的。 如何优化 选择合适的盐类型和盐浓度，不同盐增强疏水配基和蛋白质之间的相互作用的能力不同。 控制合适的样品和系统温度 仪器维护工作 使用环境 对操作环境的要求： 室内温度：4－40度 相对湿度：10－90％ 输入电压：100－240VAC 功率：400AV－900AV 重量：40KG-70KG 注意事项： 1、主机要有良好的接地；计算机和主机不要用同一电源 2、当把主机置于远端控制时，com线不要长于15m * AKTApurifier 流路图 Inlet Pump 压力感应器 混合器 在线滤器 进样阀 色谱柱 紫外检测器 电导检测器 PH计 收集器 Ni2+最常用作纯化His-标记蛋白质 Co2+也可以用作纯化His-标记蛋白质 -当目标蛋白质和离子的结合希望较弱的时 Cu2+和Zn2+最常用作纯化非标记蛋白质 -Cu2+可以和某些蛋白质强力结合，并且一些蛋白只能和Cu2+结合 -Zn2+和某些蛋白质的结合比较弱（提供更有选择性的洗脱） -Cu2+和Zn2+都可以用作纯化His-标记蛋白质 *