Northern杂交试验计划报告.docVIP

Northern 杂交试验 一 植物总RNA的提取 1）．准备工作 （1）RNase-free水的制备：用去离子水加DEPC（焦碳酸二乙酯），使其终浓度为0.01%，过夜搅拌，121℃高温灭菌30min，烘干备用。 （2）枪头及离心管：用含0.1%的DEPC的去离子水浸泡过夜，枪头盒及装离心管的容器用三氯甲烷擦拭2贬，121℃高温灭菌30min，烘干备用。 （3）研钵及其他所需玻璃器皿：在180℃烘箱中烘烤4h. （4）80%的乙醇：用RNase-free配置即可。 （5）所使用的移液枪及其他无法灭菌的仪器均使用三氯甲烷擦拭几遍。 （6）所用到的其他试剂：异丙醇和无水乙醇都应该是未开封的。 （7）其他所用到的溶液均用DEPC水配制。 主意：试验操作整个过程中都要带上口罩和手套，接触到有可能造成RNase污染的物品时要黄手套，操作尽量迅速。 2）．实验步骤 （1）将-80℃保存的拟南芥植株称量后（约200mg）迅速转移至用液氮与人的研钵中，加入液氮，不间断的研磨植物组织直至成细粉末即可。 （2）加入400微升Buffer R-I,继续研磨直至样品完全融化，并且裂解液呈透明状。 （3）见匀浆液转移至离心管中，加入150微升的Buffer R-II，漩涡振荡15 s/次，2次。 （4）12000rpm 4℃离心5min。 （5）小心吸取上清液，转移新的离心管中（切勿吸取沉淀）。 （6）12000rpm 4℃离心5min。 （7）加入250微升异丙醇，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀，放置5 min。 （8）转移溶液于复合离心管的内管中，6000rpm 4℃离心1 min。 （9）弃滤液，加入500 微升 Buffer W1A于复合离心管的内管中，12000rpm, 4℃离心1 min。 （10）弃滤液，加入700 微升 Buffer W2于复合离心管的内管中，12000rpm, 4℃离心1 min。重复一次相同的操作。 （11）弃滤液，12000rpm, 4℃离心1 min。 （12）将内管转移到一新的离心管中，往内膜中央加100微升Buffer TE。室温放置1 min后，12000rpm, 4℃离心1 min，洗脱液即为所提取的植物总RNA。 注：脱盐液以上用到的溶液（试剂盒提供） Buffer R-I：细胞裂解液 Buffer R-II：平衡液 Buffer W1A：清洗液，须实验前加相应量无水乙醇后使用 Buffer W2：，须实验前加相应量无水乙醇后使用 Buffer TE：10 mM Tris-HCl,0.1 mM EDTA,PH 7.5 RNA样品质量分析：完整的总RNA样品应呈现出三条条带，分别为28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应约为18S rRNA条带亮度的2倍，这表明RNA样品比较完整，基本无降解。如果两条带的亮度反过，则说明RNA样品已发生降解。如果在点样槽内或槽附近有荧光区带，则表明RNA样品中有DNA污染。植物总RNA中28S rRNA及来18S rRNA在变性胶上的迁移率相当于分子量5.1kb及2.0kb RNA的迁移率，以此可作为分子量的参考。 （1）纯化 ① DNase I 处理(DNase I,RNase Free) 在微量离心管中配制下列反应也，全量200微升。 总RNA 50ug 10×DNase I Buffer 20ul DNase I（RNase-Free，5U/ul）Mrna Washing Buffer于内管中，用力上下颠倒混匀，26℃，1200rpm振荡孵育30min。 ⑧ 弃去外管中的滤液。转移内管于新的外管中，加400ul mRNA Elution Buffer（70℃预热）与内管中，用力上下颠倒混匀，26℃，12000rpm离心1min。，收集滤除液于新的2ml离心管重中，重复相同一次操作。 ⑨ 加1/10体积的3M NaAc(PH5.2)于洗脱液中，混匀。再加入等体积异丙醇，混匀，-20℃放置30min. 12000rpm，4℃离心30min。 ⑩弃去上清液，12000rpm，4℃离心1min，用微量枪头吸去残留乙醇，通风橱，室温放置2到5min。 用 20ul RNase-Free溶解。 （2）cDNA合成 （用 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit,TaKaRa,Code D6110A,进行反转录） A 反转录 ①在Microtube